تاريخچه :

اين بيماري كه سبب مرگ وميربالايي در پرندگان عفوني مي شود براي اولين بار در سال 1878 ،بيش از صد سال پيش در ايتاليا شناخته شد . تا اوائل سال 1901 نشان داده شد كه ميکروارگانيسم عامل اين بيماري يك ويروس مي باشد اما هنوز تا سال 1955 ارتباط بين اين بيماري و ديگر ويروسهاي ملايم جدا شده از پرندگان با ويروسهاي آنفولانزايA پستانداران مشخص نشده بود(براي اولين باردردهه930 ) .
آنفولانزاي مرغي در ايالت متحده در سال 25 ـ 1924 شايع شد و در سال 1929 دوباره اين شيوع رخ داد در حالي كه هر دوبار ريشه كن شد .
يك پاندمي بزرگ از آنفولانزاي مرغي بسيار پاتوژن در شمال شرقي ايالت متحده در سال 84 ـ 1983 رخ داد . بيش از دو سال وقت و70 ميليون دلار هزينه براي ريشه كني آن صرف گرديد و بطور تخميني 17ميليون پرنده طي برنامه ريشه كني معدوم شدند .
فقط ويروسهاي آنفولانزاي تيپ A بعنوان عوامل طبيعي عفونت زائي در پرندگان شناخته شده بودند در حالي كه 9 تحت تيپ NA و15 تحت تيپ HA از آنفولانزاي تيپA كه به احتمال خيلي زياد به صورت تركيبي با هم مي باشند از گونه هاي مختلف پرندگان جدا شده اند .
ايالت متحده هيچ شيوع وسيعي از سال 1986 نداشته است اگر چه سويه هاي كم پاتوژن در حال حاضر وجود دارند وخسارات قابل توجه اي نيزبه بارمي آوردند.
در سال 97 ـ 1996 تعدادي از مزرعه هاي تخم گذار در مناطق لبانون و لنكستر تيتر PA آنها براي آنفولانزاي مرغي H7N2 مثبت شد . اين سويه براي جوجه ها غير بيماري زا بود ولي داراي اثرات وسيع مخرب برروي صنعت طيور بود .
در سال 1994 يك شيوع آنفولانزاي مرغي در مكزيك رخ داد كه به صورت ملايم و خفيف شروع شد اما در اثر موتاسيون به يك ويروس كشنده تبديل شد وسبب تلفات سنگيني در گله طيور گوشتي گشت .
يك سناريوي مشابه در شمال شرقي ايالت متحده در اواسط 1980 رخ داد .
سرو تايپ بسيار پاتوژني كه سبب شيوع در سالهاي 84 ـ 1983 در ايالت متحده و مكزيك گرديد H5N2 نام داشت .
از نظر تاريخي ، سروتايپهاي H5 و H7 با بيماري هاي با حدت بالا در طيور همراه هستند .

پرندگان وحشي :

اولين جداسازي ويروس آنفولانزاازپرندگان شكاري درسال1961 از پرستوهاي معمولي (stema hirundo) در جنوب آفريقا صورت گرفت ، اما تا اواسط دهه1970 هيچ گونه تحقيق سيستماتيكي برروي آنفولانزا در پرندگان شكاري انجام نگرفت بود . شواهد نشان مي دهند كه مخازن مهم ويروسهاي آنفولانزا پرندگان شكاري مي باشند و ويروس مي تواند در اين جمعيت ها پايدار بماند .

پرندگان قفسي :

از سال 1975 زماني كه اولين جداسازي از پرندگان قفسي به ثبت رسيد مشخص شد كه تمامي نمونه هاي جداشده از پرندگان قفسي بطور عمده از تحت تيپ H3 و H4 مي باشند .ويروسهاي آنفولانزاي مرغي بطور عمده از گونه هاي گنجشكيان جدا مي شوند و به ندرت گونه هاي طوطي سانان (psittacin) را درگير مي سازند .
گر چه در صورت وجود ويروسهاي آنفولانزا در پرندگان يك منطقه موقع خروج آن از كشور حتي تا سالها بعد ازجدا نشدن ويروس ازآن منطقه پرندگان رادرقرنطينه براي مدت دوره كمون تحت مراقبت نگه مي دارند.
مثالهاي تأئيدشده اي از عفونت هاي انساني با ويروسهاي آنفولانزا از سال 1997:
1997:در هنگ كنگ ، آنفولانزاي مرغي تيپA (H5N1)هم جوجه ها هم انسانها را عفوني ساخت ، اين اولين باري بود كه ويروس آنفولانزاي مرغي مستقيماُ از پرندگان به انسان منتقل مي شد .
طي اين شيوع 18 نفر بستري شدند و 6 نفر از آنها از بين رفتند .براي كنترل شيوع مسئولين تقريباُ 5/1 ميليون جوجه را از بين بردند براي اينكه مخزن ويروس را از بين ببرند. دانشمندان نشان دادند كه ويروس ها ابتدا از طريق پرندگان در ميان انسانها شايع شدند وانتقال شخص به شخص كمتر مورد توجه مي باشد .

احتمال پاندميك شدن يك آنفولانزاي مرغي :

تمامي ويروسهاي آنفولانزا توانايي تغيير را به طور بالقوه دارا مي باشند . اين مسئله احتمال دارد كه ويروس آنفولانزاي مرغي تغيير پيدا كند و توانايي آلوده ساختن انسان را پيدا كند و براحتي از شخص به شخص منتقل شود . بدليل اينكه اين ويروسها به طور معمول انسانها را عفوني نمي سازند باعث شده كه در ميان جمعيت انساني هيچ مصونيتي يا به ميزان خيلي كمي مصونيت در برابر آنها وجود داشته باشد . اگر يك ويروس آنفولانزاي مرغي قادر باشد انسانها را آلوده سازد وبراحتي از شخص به شخص منتقل شود يك پاندمي آنفولانزا مي تواند پيش آيد . پاندمي هاي گذشته آنفولانزا سبب مرگ ومير وخسارات اقتصادي بالايي شده اند .

در قرن بيستم 3 پاندمي رخ داده است :

1-1919 ـ 1918 :آنفولانزاي اسپانيايي : A(H1N1) ، سبب بالاترين مرگ ومير شده بيش از 500000 نفر در ايالت متحده و 20 تا 50 ميليون نفر احتمالاُ در تمام دنيا از بين رفتند . تعداد زيادي در همان روز اول بعد از عفونت وبقيه از عوارضي كه خيلي زود ظاهر مي شدند در گذشتند . تقريباُ نيمي از آنها جوان و بالغين سالم بودند .
2-1958 ـ1957 :آنفولانزاي آسيايي : A(H2N2) سبب حدود 70000 مرگ ومير در ايالت متحده شده است . اولين بار در كشور چين در اواخر فوريه 1957 شناسايي شد وآنفولانزاي آسيايي تا ژوئن 1957 در ايالت متحده منتشر شد .
3-1969 ـ 1968 :آنفولانزاي هنگ كنگي : A(H3N3) سبب به طور تخميني 34000 مورد مرگ ومير در ايالت متحده گرديد . اين ويروس اولين بار در هنگ كنگ در اوائل 1968 شناسايي شد وتا اواخر سال به ايالت متحده سرايت كرد . تيپ A(H3N3) هنوز تا امروز نيز در چرخش است . وقتي كه يك پاندمي آنفولانزاي ويروسي پديد مي آيد آن ويروس در ميان جمعيت هاي انساني مستقر مي گردد و براي سالها به چرخه زندگي خود ادامه مي دهد . مركز كنترل بيماري هاي US و سازمان بهداشت جهاني داراي برنامه هاي وسيعي براي نشان دادن ميزان فعاليت آنفولانزا در تمام دنيا مي باشند كه شامل رسيدگي سريع به سويه هاي ويروسي كه احتمال پاندميك شدن آنها وجود دارد مي باشد .
ديگر مثالهاي تأئيد شده از عفونت آنفولانزاي مرغي در انسانها :
1999 :در هنگ كنگ ، مواردي از آنفولانزاي مرغي A تيپ (H9N2) در دو كودك تأئيد شد كه هر دو بيمار بهبود يافتند و موارد ديگري تأئيد نشد . شواهد دال بر اين است كه طيور منبع عفونت بودند و راه اصلي انتقال از پرنده به انسان بوده است . اما احتمال انتقال فرد به فرد نيز هنوز باقي مي ماند . موارد ديگري از عفونت با H9N2 از mailand چين در طول سالهاي 1998 تا 1999 گزارش شد .
2003:آنفولانزاي مرغي تيپ A (H7N7) در ميان كارگران مرغداري وخانواده هايشان در نيدرلند طي شيوع آنفولانزا در مرغداري ها شايع شده بيش از 80 مورد بيماري گزارش گرديد ، (علائم به صورت عفونت چشمي به همراه علائم تنفسي بود) و يك بيمار از بين رفت . شواهدي نيز ازانتقال فرد به فرد وجود داشت .
2003 :عفونتH9N2 در يك كودك در هنگ كنگ تأئيد گرديد . كودك بستري شد اما بهبود يافت .
همچنين ويروسهاي آنفولانزا كه مسئول پاندميك هاي 1957 و 1968 بودند بوسيله نوتركيبي ژنتيكي بين انسان و ويروسهاي مرغي پديد آمدند .
همزمان با اولين گزارش انتقال داخل گونه اي ويروسهاي خوكي به انسان در سال 1974 ، موارد اسپوراديك آن از انسان جدا شد و بيشترين ميزان عفونت در سربازان عفوني در اپيدمي fort dix در ايالت متحده در سال 1976 گزارش شد . (4 )
متعاقباُ ، ويروسهاي نوتركيب آنفولانزاي خوكي به نام ويروس آنفولانزاي مرغي ـ انساني A H3N2 نشان داده شد كه مسئول دو مورد آنفولانزا در بچه هاي كم سن و سال در netherland در سال 1993 بود . اين ويروسهاي نوتركيب داراي ژنهاي شبه مرغي بودند كه پروتئين هاي داخلي را كد مي كردند و ژنهاي شبه انساني HA و NA را داشتند .

مقدمه :

ويروسهاي تيپ A آنفولانزا مي توانند تعدادي از رده هاي حيواني را شامل : پرندگان، خوكها ، اسبها ، فك و والها را عفوني سازند . ويروسهاي آنفولانزائي كه پرندگان راعفوني مي سازند ويروسهاي آنفولانزاي مرغي ناميده مي شوند.پرندگان بخصوص داراي اهميت ويژه اي هستند به دليل اينكه تمامي تحت تيپهاي آنفولانزايA در ميان پرندگان وحشي كه ميزبانهاي طبيعي و با اهميت و مورد توجه اين ويروسها مي باشند در چرخه اند .آنفولانزاي مرغي بطور معمول مستقيماُ انسانها را عفوني نمي سازند يا اينكه داراي چرخه زندگي در ميان انسانها نمي باشند .
آنها را مي توان بر اساس قدرت بيماريزائيشان به دو گروه مجزا دسته بندي كرد . ويروسهاي بسيارپاتوژن مسبب طاعون پرندگان كه امروزه بخش ويروسهاي آنفولانزاي بسيار پاتوژن را تشكيل مي دهند (HPAT) كه در آن ميزان مرگ ومير ممكن است تا 100% برسد . اين ويروسها به تحت تيپهاي H5 و H7 محدود مي شوند اگر چه تمامي ويروسهاي اين تحت تيپها سبب HPAI نمي شوند . تمام ويروسهاي باقي مانده باعث بروز بيماري ملايم و ابتدائي تنفسي مي شوند كه ممكن است بوسيله ديگر عفونتها يا وضعيت هاي محيطي تشديد گردد .
ويروسهاي آنفولانزا تيپ A بر اساس پروتئين هاي سطحي شان يعني هماگلوتينين (HA) و نورآمينيداز (NA) تقسيم بندي مي شوند . تعداد 15 تا تحت تيپ HA و 9 تا تحت تيپ NA وجود دارد . تمامي گروهها مي توانند در پرندگان يافت شوند ولي فقط 3 زيرگروه از HA ) H1وH2 وH3 ( و دو زير گروه از NA (N1 N2) داراي چرخه زندگي در ميان انسانها هستند .
آنفولانزاي مرغي معمولاُ پرندگان وحشي را بيمار نمي سازد ولي مي تواند پرندگان اهلي را شديداُ بيمار ساخته وآنها را بكشد . بطور معمول انسانها را عفوني نمي سازند ليكن تعدادي از مثالهاي عفونتهاي انساني و شيوع در ميان آنها از سال 1997 گزارش شده است .
هنگامي كه چنين عفونتهايي رخ مي دهد مسئولين بهداشت جهاني نشان داده اند كه وضعيت و نشانه هاي باليني بيماري به آنفولانزاي مرغي نزديك مي باشد و اين مي تواند بطور بالقوه باعث انتشار وسيع عفونت در ميان انسانها گردد .
امروزه قوانين وسيع حفظ امنيت زيستي از انتشار ويروس به ايالت متحده و كشورهاي همسايه جلوگيري مي كند . تلاشهاي محققان مستقيماُ برروي اينكه چگونه و چرا ويروسهاي پاتوژن تبديل به ويروسهاي بسيار پاتوژن و خطرناك مي شوند متمركز مي باشد .
اين ويروسها داراي RNA ,envelop تك رشته اي منفي كه به تايپهاي A وB وC طبقه بندي مي شوند هستند.
ژنوم ويروس آنفولانزاي A شامل 8قطعه RNA تك رشته اي مي باشد كه حداقل 10محصول ژني راكد مي كند .
ماهيت سگمنته ژنوم باعث نوتركيبي ژنها هنگامي كه سويه هاي مختلف يك ميزبان راعفوني مي سازد مي شود.
نوتركيبي ژنتيكي ، كه منجر به توليد تغييرات آنتي ژنيك در انسانها مي شود به عنوان شيفت آنتي ژنيك شناخته مي شود . تعدادي از چنين شيفتهاي آنتي ژني تاكنون رخ داده است . براي مثال ، پاندمي وخيم آنفولانزا در 1918 و 1920 بدنبال خود شروع يك عفونت ويروسي در انسانها را با يك ويروس شبه مرغي به نام H1N1 به همراه داشت و مثالهاي ديگر كه در تاريخچه ذكر شده است .
انتقال ويروسهاي كاملاُ مرغي بطور مستقيم ، بدون هيچ ميزبان واسطي مانند خوك تصور مي شود كه بوسيله رسپتورهاي اختصاصي سلولهاي انساني تعيين گردد . ليكن ، عفونت انسانها با ويروسهاي آنفولانزاي A مرغي امروزه مستند و ثابت شده است .
مثلاُ تمامي 8 قطعه ژنوم ويروس H5N1 جدا شده از انسانها در سال 1997 منشأ مرغي داشتند و 8 قطعه ژنوم H9N2 جدا شده در سال 1999 نيز مرغي بودند كه 6 قطعه ژني آن كه تركيبات داخلي را كد مي كردند مشابه آنهايي بودند كه در سال 1997 در ويروس H5N1 جدا شده از انسان و مرغ مشاهده شده بودند .
اگر چه اين گونه انتقال هاي بين گونه اي غير معمول مي باشد اما كاملاُ مشخص شده كه براي شناسايي زود بهنگام ميكروارگانيسم مسئول بيماري ضروري مي باشد . تشخيص سريع و تعيين خصوصيت ويروسهاي آنفولانزا براي مقايسه واريانتهاي جديد با سويه هايي كه اخيراُ در چرخش مي باشند و نيز با سويه هاي واكسن ضروري مي باشد .
براي اين هدف ، ويروسهاي آنفولانزايي كه در آزمايشگاههاي تشخيصي جدا
مي شوند بطور روتين براي بررسي ژنتيكي و آنتي ژنيكي به آزمايشگاه رفرنس فرستاده مي شوند .
گليكوپروتئين هماگلوتينين ويروس آنفولانزا بعنوان يك پيش ساز توليد مي شود (HAO) كه نياز به شكستن بعد از ترجمه توسط پروته آزهاي ميزبان جهت فعال شدنش دارد . پروتئين هاي HAO پيش ساز دسته كم پاتوژن آنفولانزاي مرغي داراي يك اسيد آمينه آرژنين در محل برش مي باشند و فقط توسط پروته آزهاي ميزبان مانند آنزيم شبه تريپسين محدود مي شوند بنابراين به همانند سازي در محل هايي از بدن كه اين آنزيمها يافت مي شوند محدود ميگردد ، مثل دستگاه تنفسي و روده اي . ويروسهاي HPAI داراي اساس چند آمينواسيدي (آرژنين و ليزين ) در محلهاي برش HAO هستند و بوسيله آنزيم منحصر بفرد پروته آزي اين ويروسها قادر هستند در ميان پرندگان همانند سازي كنند به ارگانهاي حياتي و بافتها آسيب برسانند كه منجر به بيماري و مرگ مي شوند .

مشخصات آنفولانزاي مرغي در پرندگان :

بطور عمده پرندگان آبزي بعنوان ميزبانهاي اصلي اين ويروسها را در روده و ترشحات آن دارا مي باشند . طيور آلوده ويروس را از طريق بزاق ، ترشحات بيني و مدفوعشان دفع ژمي كنند . آنفولانزاي مرغي در ميان پرندگان مستعد هنگامي كه آنها با ترشحات پرندگان آلوده تماس پيدا مي كنند منتشر مي شود اما در هر حال انتقال دهاني ـ مدفوعي شايع ترين مدل انتشار مي باشد .
بيشتر ويروسهاي آنفولانزا باعث بروز علائمي در پرندگان وحشي نمي شود يا اينكه فقط علائم خفيفي ايجاد مي كنند . البته ميزان بروز علائم درانواع پرندگان بسيار متفاوت مي باشد وبستگي به سويه ويروس و نوع پرنده دارد. عفونت با ويروسهاي اصلي آنفولانزاي A ( براي مثال تعدادي از سويه هاي H5 وH7 ) مي تواند باعث شيوع گسترده بيماري ومرگ ومير در ميان تعدادي از پرندگان وحشي و بخصوص پرندگان اهلي مانند جوجه ها و بوقلمون مي شود.

علائم آنفولانزاي مرغي در انسان :

علائم گزارش شده داراي طيفي از علائم آنفولانزاي تيپيك (براي مثال تب ، سرفه ، گلودرد ودرد ماهيچه ) تا علائم چشمي ، پنومونيا ، اختلالات حاد تنفسي ، پنومونيا ويروسي ، و ديگر عوارض تهديد كننده سلامت مي باشد .

انتقال :

پرنده آلوده ويروس را در مدفوع و ترشحات مجراي بيني دفع مي كند . تصور مي شود كه گله هاي بهبود يافته نيز ويروس را البته به ميزان كمتري نسبت به گله هاي با بيماري حاد دفع كنند .
مرغ هاي وحشي واهلي جزء اولين مخازن ويروسهاي آنفولانزا هستند . مرغابي وحشي معمولاُ علائم كلينيكي را نشان نمي دهد ولي مي تواند براي مدت طولاني ويروس را حمل كند . بعلاوه ، مرغابي مي تواند با بيش ازيك نوع ويروس عفوني گردد . تعيين تايپها با اين مشكل همراه است كه آنتي بادي قابل جداسازي در خون اين پرندگان بعد از در معرض قرار گرفتن يافت نمي گردد . ويروس آنفولانزاي موجود در آب و مواد معدني ,آلي ، درياچه ها و استخرها توسط مرغابي هاي عفوني دوباره وارد چرخه مي شود . مخلوط شدن اين پرندگان با مرغابي هاي پرورشي يكي از فاكتورهاي دخيل در بروز تعدادي از همه گيري ها مي باشد .
ويروس آنفولانزاي مرغي مي تواند براي مدتهاي طولاني در دماهاي معتدل زنده باقي بماند. ودر موارد فريز شده نيز براي مدت نامحدود زنده باقي مي ماند .
بنابراين بيماري مي تواند از طريق دفع غلط اجساد وكود ويا ديگر محصولات طيور منتشر گردد .
همچنين اين بيماري مي تواند براحتي توسط مردم و وسايل آلوده به ويروس آنفولانزا منتشر گردد . اين ويروس مي تواند برروي كفش هاي آلوده ، لباسها ، صندوق ، كارتن هاي تخم مرغ ، حاملين وديگر تجهيزات انتقال پيدا كند.تمام محل هاي مزرعه طيور آلوده بايستي مورد توجه قرار گيرند وبطور كامل تميز وضد عفوني شوند ، قبل از اينكه مجوز انتقال به آنها داده شود لباسهايي كه در مزرعه آلوده پوشيده شده بايد حتماُ شسته شوند .
حشرات وجوندگان ممكن است بطور مكانيكي ويروس را از پرندگان آلوده به پرندگان مستعد حمل كنند . ويروس آنفولانزاي مرغي از تخم هاي اردك جدا شده است و اين مسئله احتمال انتقال عمودي يا vertical را مطرح مي سازد اگرچه بطورتيپيك ويروس جنين تخم مرغ رامي کشد . شواهد كم و ناچيزي ازعفونت جوجه با منشأتخم در دست مي باشد . ولي سطح پوسته تخم مرغها مي تواند با ويروس آلوده شود در نتيجه يك راه انتقال محسوب مي شود .
ويروس آنفولانزاي مرغي بكرات از پرندگان وارداتي سالم جداشده است . اين پرندگان آلوده يك خطر بالقوه براي پرندگان قفسي ، وحشي و گله هاي طيور پرورشي محسوب مي شوند . مغازه هاي فروش پرندگان زنده يك مخزن عفونت مي باشند . اين مغازه ها اغلب انواع پرندگان خانگي و زينتي را مي فروشند و به ندرت اين محل ها تميز يا ضد عفوني مي شوند .
اين سيستم كه انواع مختلف طيور استرس ديده را با هم مخلوط مي سازد يك عامل كليدي در شيوع آنفولانزا در تجارت طيور مي باشد .
صاحبان مرغداريها خود اولين خط دفاعي براي شناسايي شيوع آنفولانزاي مرغي هستند . اگر پرندگان در نشان دادن علائم آنفولانزاي مرغي پيشرفت كردند بايستي بلافاصله به سازمانهاي مسئول اطلاع دهند .

پيشگيري :

برنامه واكسيناسيون ، مراقبت سخت در طول مدت دوره چهل روزه پرورش طيور براي كنترل فرمهاي خفيف بيماري در گله هاي مرغي و اردكها مورد استفاده قرار مي گيرد . اما در مورد بيماري هاي كشنده تر مراقبت سخت درطول دوره وجداسازي جوجه هاي آلوده تنها روش مؤثر در متوقف كردن آنفولانزاي مرغي مي باشد.
موفقيت در چنين برنامه هايي بستگي به همكاري كامل و حمايت دولت از صنعت طيور دارد .
با شناخت اين مسئله كه مخزن آنفولانزاي مرغي مرغابي هاي وحشي مي باشند هر كوششي بايد بر اساس جلوگيري از تماس مستقيم و غيرمستقيم بين پرندگان خانگي و مرغابي هاي وحشي طرح ريزي گردد .(2)
WHO (سازمان بهداشت جهاني) و مديريت عفونتهاي انساني از طريق كنترل آنفولانزاي A(H5N1) اين راهنمايي ها بر اساس اطلاعات موجود از عفونتهاي آنفولانزاي انساني A (H5N1) كه از تجربيات بدست آمده از شيوع 1997 در هنگ كنگ يك منطقه اختصاصي اداري از چين و از گزارشات اوليه از موارد اخير در تايلند و ويتنام استخراج شده است . همانطور كه اطلاعات بيشتر بدست مي آيد اين راهنمايي ها نيز بطور مناسب تغيير پيدا مي كند .(2)

توجه :

مفهوم اوليه كنترل عفونت رعايت احتياط براي به حداقل رساندن انتشار تنفسي بيماري مي باشد .
مديريت مناسب براي پيشگيري از بيماري حاد ومرگ ومير شناسايي زود هنگام و دنبال كردن افرادي كه در رسيك ابتلاء هستند . به منظور درمان آنها با داروهاي ضد ويروسي براي كاهش ميزان مرگ وميرو انتشار بعدي بيماري .

هشدارهاي عمومي :

كنترل عفونت موجود شامل به كار بردن احتياط هاي استاندارد براي تمام بيماراني كه به بيمارستان مراجعه مي كنند مي باشد .
اگر كه تشخيص آنفولانزاي A (H5N1) بر اساس علائم باليني داده شود بايستي احتياطهاي اضافي تا موقعي كه تشخيص رد شود رعايت گردد .
در آن كشور ها وسرزمين هايي كه ويروس هاي آنفولانزاي A(H5N1) بعنوان يك عامل بيماري زائي در جمعيت هاي حيواني شناسايي شده است ، تشخيص آنفولانزاي H5N1 بايستي با ديگر بيماريهاي حاد تنفسي تمايز داده شود . اشخاصي كه هم با طيور بيمار وهم با طيوري كه از بيماري تلف شده اند در تماس هستند در معرض ريسك ابتلاي بيشتري هستند .
كشور ها يا سرزمين هايي كه بطور تجربي با شيوع آنفولانزاي مرغي با بيماريزايي بالا مواجه هستند بايستي افرادي كه در بخش بهداشت و پزشكي كار مي كنند با واكسن فصلي نو تركيب سازمان بهداشت جهاني واكسينه شوند . بطور منطقي اين موضوع سبب كاهش فرصت ايجاد عفونت در انسانها توسط ويروس آنفولانزاي مرغي مي شود ولي درعوض،فرصتي را براي بازآرائي وظهورآنفولانزاي جديد با قدرت جهاني شدن پديد
مي آورد.
-كنترل عفونت و پيشگيري از انتشار تنفسي آنفولانزاي :A (H5N1)
انتقال آنفولانزاي انساني بوسيله قطرات و ذرات منتشر در هوا صورت مي گيرد . انتقال توسط تماس مستقيم و غير مستقيم نيز شناسايي گرديده است . ليكن در طول سال 1997 آنفولانزاي A (H5N1) در انسانهادر SAR هنگ كنگ ، رعايت احتياط هاي مربوط به انتشار قطرات و تماس مستقيم بطور موفقيت آميز از انتشار بيماري جلوگيري كرد .
بدليل درصد بالاي مرگ ومير بيماري و احتمال موتاسيون ويروس كه باعث انتقال فرد به فرد شود سازمان بهداشت جهاني استفاده از ماسكهاي بسيار مؤثر به منظور رعايت احتياط هنگام تماس و برخورد با قطرات معلق توصيه كرد . بعلاوه اگر كه يك اطاق با فشار منفي در دسترس باشد بهتر مي باشد .
ايزوله كردن بيمار در يك اتاق ، اگر كه يك اتاق جداگانه در دسترس نباشد بيماران بايستي به طور جداگانه در يك بخش يا اتاق مجزا بستري شوند . تختها بايستي يك متر با هم فاصله داشته باشد و بهتر است كه تختها بوسيله يك سد فيزيكي مثل پارتيشن از هم مجزا گردند .
مناسبترين روش براي محافظت اشخاصي كه وارد اتاق مي شوند استفاده ازگان ، ماسكهاي بسيار قوي ، محافظ صورت يا عينك و دستكش مي باشد . تعدادمحدودي از كاركنان سازمان بهداشت جهاني (HCW) كه داراي تماس مستقيم با بيماران بودند نبايستي با بيماران ديگر برخورد كنند .
تعداد ديگري از كارمندان بيمارستان (مانند نظافت چي ها و پرسنل آزمايشگاه) كه با محيط اين بيماران در تماس هستند همچنين بايستي محدود گردند .
بايستي از HCW ها (پرسنل بيمارستان ) كه در تماس با بيماران هستند خواسته شود كه روزانه دوبار دماي بدنشان راچك كنند وهرگونه تبي را به مسئولين بيمارستان گزارش دهند . يك HCW كه داراي تب بالاي 37c است و در تماس مستقيم با بيماران بوده است بلافاصله بايستي درمان شود .
راهكارهاي پيشگيرانه بعد از در معرض قرار گرفتن (براي مثال: داروهاي خوراكي oseltamivir به ميزان روزانه 7mg براي 7روز) براي پرسنل بيمارستاني كه احتمال تماس با ترشحات افراد بيمار برايشان وجود دارد توصيه مي شود HCW هايي كه حال عمومي خوبي ندارند نبايستي با بيماران در تماس مستقيم باشند چرا كه آنها آسيب پذير هستند و ممكن است كه وقتي كه در معرض ويروس H5N1 قرار گيرند بيماري حاد تري را روي كاربياورند .

مديريت بيماران :

گرفتن نمونه خون ودستگاه تنفس و ارسال به آزمايشگاه براي تست آنفولانزا و ديگر عفونتهايي كه علائم باليني مشترك دارند .
درمان با اينهيبيتور نورآمينيدازها مانند oseltamivir (بصورت 75mg خوراكي ، دوبار در روز) بعنوان اولين مراحل درمان بكار ميرود .
اگر كه علائم باليني ظاهرشد بيمار بايستي در بخشي كه قبلاُ توضيح داده شد براي كنترل عفونت بستري گردد.
اگر كه تشخيص داده شد بيمار نياز به بستري شدن ندارد بايستي به بيمار وخانواده اش ضوابط بهداشت فردي و كنترل عفونت (براي مثال: شستن دستها، استفاده از ماسك كاغذي يا جراحي براي شخص بيمار وپرهيز از تماس جمعي) آموزش داده شود اگر كه نياز دارد توسط دارو تحت درمان حمايتي قرار گيرد همچنين بيمار با پزشك معالج توسط تلفن ويا ويزيت شدن در تماس باشد .درمانهاي حمايتي شامل مراقبت از اشباع بودن اكسيژن واستفاده از ذخيره اكسيژن در صورت كم شدن اكسيژن ماسكهاي اكسيژن nebulizer ويا high-air-flowدر سندرم عفونت حاد تنفسي براي پيشگيري از انتشار تنفسي بكار مي رود .
اين توصيه ها فقط هنگامي كه بيماري شديد باشد و كنترل آن مشكل مي باشد مورد نياز هستند .
گرفتن نمونه هاي خون وتنفسي بطور مرتب براي چك كردن عفونتهاي باكتريايي احتمالي مورد نياز مي باشد . استفاده از درمان آنتي بيوتيكي به صورت تزريقي را نيز بايد در نظر داشت . از آمانتيدين يا ريمانتيدين استفاده نكنيد بدليل خطر افزايش موتاسيون انتخابي در جهت مقاومت ويروسي با توانايي جهاني شدن . نتايج اوليه كه توسط مراكز مختلف بهداشت جهاني بدست آمده پيشنهاد مي كند كه ويروس آنفولانزاي A (H5N1) كه اخيراُ از انسانها جدا شده اند نسبت به آمانتيدين وريمانتيدين مقاوم مي باشند .
پرهيز از تجويز ساليسيلاتها (مانند آسپيرين) در بچه هاي زير 18سال بدليل ريسك سندرم reye .
استفاده از paracetamol يا ibuprofen با هم بصورت خوراكي يا شيافت براي كنترل تب.
تعديل كنندهاي سيستم ايمني مانند كورتيكواستروئيدها بايستي فقط به موازات عمليات كلينيكي صورت گيرد. پاسخ ايمني انسان در مقابل آنفولانزاي A (H5N1) هنوز نياز به مطالعات بيشتري دارد .
از ribavirin استفاده نكنيد. هيچگونه شواهدي دال بر مؤثر بودن اين دارو بر عليه آنفولانزا وجود ندارد در عوض عوارض ناخواسته مانند آنمي شايع مي باشد و ممكن است كه بيمار را بيشتر به مخاطره بياندازد .
براي فهم بهتر الگوي دفع ويروس در انسانهاي عفوني شده با ويروسها A (H5N1) در شيوع آنفولانزا در تايلند وويتنام نياز به مطالعات بيشتري مي باشد . تا اينكه شواهد ديگري به دست آيد در حال حاضر WHO توصيه كرده است كه ضوابط كنترل عفونت تا 7روز بعد از قطع تب ادامه پيدا كند .
مطالعات قبلي برروي آنفولانزا براين امر كه كودكان باسن كمتراز 12سال مي توانند براي 21روز پس از شروع بيماري ويروس را دفع كنند مي باشد . بنابراين ، براي كنترل عفونت بهتر است كه كودكان براي اين دوره در محل مراقبت باقي بمانند . كودكان در اين مدت نبايستي به مدرسه بروند .
افرادي كه بااين بيماران در تماس مستقيم بوده اند بليستي براي 7روز تحت نظر قرار گرفته شوند ودماي بدن آنها دوبار در روز چك شود اگر كه فردي تب بالاتر از 38c و سرفه يا تنگي نفس را نشان داد بايستي بلافاصله درمان شود .
آنفولانزاي مرغي جديد در دانمارك،10000 اردك را ازبين برد .
ويروس A H5N1 در اردكها شناسايي شد .
يك نوع جديد ويروس A آنفولانزا ،H5N1 ، براي اولين بار در اردكهاي دانماركي شناسايي شد . بدنبال ظهور بيماري بين 12000 اردك . در يك مزرعه اردك نزديك به شهر salling در jutland دو ويروس شناسايي شدند: يك ويروس عامل Entritis در اردك (DVE) ،كه عامل بيماري بود ويك ويروس آنفولانزاي A .
تمامي اردكها بطور خيلي وسيعي در 10 سپتامبر 2003 درگير بيماري شدند . ويروس آنفولانزايA از بافت تعدادي از اردكها جدا شد . انستيوسرم سازي statens از RT – PCRطول كامل هماگلوتينين ونورآمينيداز با تعيين توالي روتين كه ترجيحاُ بطور مستقيم برروي نمونه ها انجام مي گيرد تا برروي ويروسهاي كشت داده شده استفاده كردند و ژنوتيپ اين ويروس را H5N7 نام نهادند .
اين تايپ قبلاُ هيچ گاه شناسايي نشده بود وبررسي هاي بيشتر هم اكنون برروي آن در حال انجام است . نكته با اهميت اينكه اين ويروس در انسانها تشخيص داده نشده بخصوص در ميان افرادي كه با اين اردكها تماس داشتند يا در تعدادي موارد غير مرتبط ويروس آنفولانزاي (H3N2) A در دانمارك از 1 سپتامبر 2003 تشخيص داده شد .12 سويه ويروس آنفولانزاي مرغي (AIV) A از پرندگان وحشي در دانمارك از 1996 جدا شد كه هيچ كدام از آنها H5 يا H7 نبود .
پرندگان وحشي مخزن طبيعي آنفولانزاي مرغي هستند (AIV) . اگر چه ويروسهاي كم پاتوژن H5 وH7 وجود دارد ولي تمامي ويروسها با بيماري زايي بالا يا H5 يا H7 هستند . پاتوژنسيته ويروسهاي AIV H7 و H5 حداقل تا قسمتي وابسته به توالي آمينو اسيدي در محل برش در HA1/HA2 دارد. چنين توالي هاي پاتوژنيكي يافت نشدند . بنابراين اين سويه AIV در گروه ويروسهاي باپاتوژنسيته پائين قرار گرفت . توانايي تغيير پاتوژنسيته مثلاُ طي تكثير در پرندگان يا نوتركيبي در خوكها ويا انسانها شناسايي نشده است . ويروسهاي بسيار پاتوژن AIV از تيپ H5 و N7 اغلب انسانها را درگير مي سازند .اين مسئله در سال 1997 در هنگ كنگ رخ داد (H5N1) كه 6 نفر از 18 فرد آلوده شده از بين رفتند ودوباره در سال 2003 كه يكي از دو فرد آلوده شده مردند ودر سال 2003 در Netherland سويه H7N7 شايع شد كه 1 نفر از هر 80 بيمار از بين رفتند . سازمان بهداشت جهاني تصويب كرد تمامي كشورها كميته هاي بين المللي در مورد مديريت اپيدمي هاي آنفولانزا تشكيل گردد .
شبكه هاي آزمايشگاهي نظارتي و روشهاي ژنوتايپ كردن بايستي با كارهاي اين كميته هاي بين المللي هماهنگ شود .
ويروسهاي آنفولانزاي مرغي عوامل مشترك بين انسان وحيوان مي باشند كه بعنوان يك خطر مداوم سلامت جمعيت هاي انساني وحيواني را تهديد مي كند . طي 6 سال گذشته، عفونت انسانها با ويروسهاي آنفولانزاي مرغي از 3 تحت تيپ (H5, H7, H9) بكرات تشخيص داده شده است .
ويروس آنفولانزاي مرغي H7N7 كه سبب آنفولانزاي شديد در 225 مزرعه طيور در هلند در سال 2003 شد همراه با عفونت ملتحمه چشم (conjunctivitis) در 347 انسان بود . عفونت با ويروس H7N7 در 87 مورد، مورد تأئيد قرار گرفت ، يك نفر دامپزشك در اثر عفونت جان سپرد . شواهدي از انتقال فرد به فرد ويروس و ايجاد عفونت درخوكها دردست مي باشد . اين شيوع بوسيله جداكردن وقرنطينه كردن طيور عفوني كنترل شد . براي جلوگيري از پديد آمدن وانتشار ويروس نوترتيب مرغي ـ انساني كارگران مرغداريها بوسيله واكسن آنفولانزاي انساني واكسينه شدند وداروي آنتي نورآمينيداز به آنها داده شد .
انتقال آنفولانزاي مرغي H5N1 به انسانها در سال 1997 ثابت كرد كه اين ويروس علي رغم اينكه ترجيح مي دهدبارسپتورهاي سياليك اسيدمرغي باند شوند توانايي انتقال به انسان رادارد (براي مثال آنهابايك gal 3 و2 × انتهايي لينك مي شوند .)
قبل از 1997، گزارشاتي از عفونتهاي انساني باH7N7 وجود داشت (معمولاُ باعث عفونت ملتحمه مي شد) ، اما شواهد محكمي دال بر انتقال مكرر ويروسهاي مرغي به انسانها دردست نبود . چگونه ويروسهاي آنفولانزاي مرغي در ايجاد عفونت در پستانداران به طور تصاعدي قوي تر شده اند؟
ارزيابي تلفيق PCR با MOBILITY هترودوبلكس براي تعيين و تشخيص ويروسهاي آنفولانزاي A از انواع حيوانات :

خلاصه :

انتقال ويروسهاي آنفولانزاي A از حيوانات ميزبان به انسان ممكن است به پديد آمدن گونه هاي جديد با همه گيري جهاني شود . تشخيص زود بهنگام چنين وقايعي در ابقاء ويروسهاي آنفولانزا در درحه اول اهميت قرار دارد . براي تشخيص و تعيين خصوصيت نسبي ويروسهاي آنفولانزاي A از گونه هاي مختلف حيوانات روش توأم RT-PCR و (HMA) heteroduplex mobility طراحي گرديد. نشان داده شد كه اين تغيير پذيري (m) ژن در RT-PCR مي تواند حساس شود و براي تعيين ويروسهاي آنفولانزاي A انساني و مرغي وخوكي اختصاصي گردد.
قطعات تكثير شده توسط PCR از ويروسهاي انسان ، طيور وخوك از 15 تحت تيپ مختلف،با بين 9/1 و4/21 اختلاف نوكلئوتيدي بوسيله روش HMA تمايز گذاشته شد .
تعيين توالي ampliconها نشان داد كه الگوي تغيير پذيري هترودوبلكس بااختلاف توالي ها بين DNA مورد آزمايش ورفرنس مرتبط مي باشد . متد تكثيرRT-PCR HMA براي جستجوي سريع نمونه ها با يك پانل رفرنس از منشأ ويروسهاي انساني ومرغي وخوكي تشخيص داده شد .
ويروسهاي مرغي (A / Hongkong / 1073 / 99) H9N2 كه با گونه هاي انساني واكنش متقاطع داشتند در مقابل panel رفرنس مورد بررسي قرارگرفتند . مشخص شد كه محصولات PCRاين سويه بيشترين شباهت را با سويه (A / Quil /Hongkong / GI / 97 ) H9N2 دارد. بررسي توالي ها نشان داد يك اختلاف 101% نوكلئوتيديبين قطعات amplicon مربوط به A / Quil /Hongkong / GI / 97 و A / Hongkong / 1073 / 99 وجود دارد . با توجه به نتايج كار ما ، روش RT-PCR HMA يك راه سريع و حساس براي جستجوي ويروسهاي آنفولانزاي جديدوغيرمعمول مي باشد.شناسايي ويروسهاي آنفولانزا معمولاُ شامل رشد ويروس در كشت بافت يا جنين تخم مرغ ، قبل از بررسي تايپها يا ساب تايپها بوسيله ممانعت از هماگلوتيناسيون (HI) مي باشد .
ليكن ، اين كارها وقت مي برد وشناسايي گونه هاي منشأ ويروس ضروري نمي باشد . به همين دليل ماروش (RT) – PCR براساس ژن ماتريكس (M) توأم با روش هترودوبلكس (HMA) mobility برروي محصولات PCR پايه گذاري كرديم .
پروسه خالص سازي نوكلئيك اسيدهاي ويروس باشناسايي توسطHMA24 تا36 ساعت وقت مي برد و مي توان بطور مستقيم آن را برروي نمونه هاي كلينيكي انجام شود . روش RT-PCR HMA كه در اينجا شرح داده مي شود به تشخيص زود به هنگام انتقال داخل گونه اي بين ميزبانهاي انساني وحيواني كمك خواهد كرد .

مواد و روشها :

جداسازي ويروس :

ويروسهاي آنفولانزا درحفره هاي آلانتوئيك جنين تخم مرغ رشد مي كند . مايع حاوي مايع آلانتوئيك جداسازي شده ودردماي 70c تا موقع مورد نياز نگهداري مي شود .ويروسهايي كه در اين مطالعه استفاده شده اند .
ويروسهاي /Taiwan/7310/10 ، A/SW/oms/2899/82 ، A/SW/oms/3633/84، /SW/Scotland/410440/94 ، A/SW/hongkong/168/93 ،A/HK/1774/99 و A/HK/1073/99 بوسيله yipu lin و alan hay مؤسسه بين المللي تحقيقات پزشكي در mill hill انگلستان فراهم شد .
جدا سازي A/DUCK/singapor q/f 119-3/97 بوسيله آزمايشگاه دامپزشكي منشعب از مركز دامپزشكي سنگاپور انجام گرفت .
ويروس تايپنگ : ويروسهاي آنفولانزا كه تايپ مي شوند با استفاده از آنتي سرم موش خرما همانطوري كه قبلاُ شرح داده شد انجام مي شد . تمام تستهاي HI با استفاده از HAU 8 از ويروسها و 5% سلولهاي قرمز (vol/vol) turkey انجام گرفت .
سنتز cDNA وخالص سازي نوكلئيك اسيد :
RNA ويروسي از يك ميزان 150mg از نمونه بوسيله روش باند شدن با گوآنيدينوم تيوسيانات باسيليكا همانطوري كه قبلاُشرح داده شد انجام گرفت . rna ويروسي در 30 از نوكئازها وآب آزاد حل مي شود .
RT از RNA به CDNA بوسيله اضافه كردن 2/22 از RNA به 8/17 مخلوط RT حاوي 20Mm Tris-Hcl (PH=8/4) ، 50 Mm ، KCL و 7/5 Mm ، mgcl2 و 3Mm از هر داكسي نوكلئوتيد تري فسفات و 25ng از پرايمرهاي راندم (pdn6) و 1/6 u از rnasine و2007 از revers transcriptase ويروس لوسمي موشي (moloney) انجام
مي شود .
اين مخلوط در دماي 20c براي 10 دقيقه انكوبيت مي شود وسپس در 37c براي 45 دقيقه نگهداري مي گردد . سپس نمونه ها براي 65 دقيقه تا 100c حرارت مي بينند وبعد روي يخ گذاشته مي شوند .
مواد اصلي PCR : توالي هاي پرايمر بدنبال بررسي نواحي حفاظت شده از ژن m مربوط به ويروسهاي آنفولانزاي A بدست آمدند.خصوصيات پرايمرها بانرم افزار oligo primer analysis بررسي مي شوند .جفت پرايمري كه در مايه RT- PCR مربوط به m gene مورد استفاده قرار مي گيرددر جدول شماره 2 آمده است.
پرامر خارجي ،amp71f قبلاُ براي استفاده در يك مايه pcr براي تعيين ويروسهاي آنفولانزاي انساني طراحي شده است . هر جفت پرايمر در مجاورت مقدار مشخصي از mgcl2 ، نمك و PH انجام مي گيرد. براي PCR اوليه، 20 L از cdna به 80 L مخلوط PCR حاوي 8 L از بافر 10XPCR ((PH : 8/4) tris- hcl , 200Mm و kcl 500ml ) و2/4 l از mgcl2 50mm و 1 l ازهرپرايمر خارجي در l (amp 71f ,amp831r ) 5 pmol/
و 6/7/3 l از نوكلئاز – آب آزاد و /3 l از DNA, taq پلي مراز استفاده مي شود .
دماي اپيتيم براي چسبيدن براي جفت پرايمروحالت چرخشي بااستفاده از يك mastercycler Gradient thermalcyler تعيين مي گردد . تكثير اوليه بوسيله 1 سيكل در دماي 94c براي 2 دقيقه انجام مي شود وبعد با 30 سيكل دناتوره كردن در دماي 94cبراي يك دقيقه دنبال مي شود وتواماُ چسبيدن وطولاني شدن در دماي 68c براي 1/5 دقيقه انجام مي شود . محصولات اوليه تكثير يافته از ويروس هاي رشد كرده برروي تخم مرغ به نسبت 1 در 10000 قبل از تكثير ثانويه رقيق مي كردند . يك مقدار از محصول اوليه (2 l) سپس به 48 l از مخلوط ثانويه pcr حاوي 5 lاز10 xpcr buffr (ph:8/4)tris-hcl ,200mm) و (kcl 500mm و 1 l از مخلوط داكسي نوكلئوزيد تري فسفات و 1/5 l از 3 l , 50mm mgcl2 ازهر پرايمر داخلي در 25 pmol/ l (amp227f , amp 622r) و 34/2 l از نوكلئاز-آب آزاد و /3 l از DNA, taq پلي مراز اضافه مي كنيم . نمونه ها در دماي 94c براي 1 دقيقه انكوبيت مي شوند وسپس براي 32 سيكل در معرض 94c به مدت 1 دقيقه و60c براي يك دقيقه و72c براي يك دقيقه قرار مي گيرند .
Amplicon هاي (413bp) بوسيله رنگ آميزي با اتيديوم برومايد قابل رؤيت مي شود و متعاقبأ برروي ژل آگارز2% الكتروفور مي شود . -تعيين حساسيت روش (I RT-PCR) تيتراسيون عفونت زايي ويروس :
روش هاي عفونت زايي همانطور كه قبلاُشرح داده شدبا تغييرات كوچكي انجام مي گيرد . تعداد10رقت (10 -10)
از ويروسهاي syd/97(h3n2) و DK/sing/97(h5n3) و HK/1073/99(h,n2) در محيط ترانسپورت ويروسي تهيه گرديد . (vtm) ذمان انكوباسيون به 72 ساعت دريك انكوباتور co2 در 37c تغيير پيدا مي كند . سلولهاي كليه سگ madin-darby بوسيله گلوتارآلدئيد5% فيكس گرديدند وپلاكه بوسيله رنگ آميزي با محلول كربول فوشين 5% vol/vol قابل رؤيت شدند .
RT-PCR(ii) : مقداري ازمحلول تازه وزنده ازهرويروس(100 l) حل شده در vtm در مجاورت عصاره نوكلئيك اسيد و RT-PCR همانطوركه قبلاُشرح داده شد قرارداده مي شود .

روش Heterduplex :

متدهاي آناليز hma كه قبلاُ شرح داده شد براي مطالعه گونه هاي مشابه ويروس نقص ايمني انسان تيپ 1 آداپته شدند . براي hma ، 3 l از نمونه محصول pcr با 3 l ازمحصول pcrرفرنس و /3 l از بافر hmaحاوي1 m nacl و 100mm tris (ph:7/8)و 20mm edta مخلوط مي گردد.
نمونه ها سپس در دماي 95cبراي 2 دقيقه دناتوره مي شوند وسريعاُ تا دماي4c سرد مي شوند . سپس براي 10 دقيقه برروي يخ گذارده مي شوند .سپس بافر(1/3 l) gel loading اضافه مي شود .
برم فنل بلو1% و glycerol و(g x ; tris-boric acid-edta{tbe} , 1% xylen cynol) نمونه ها برروي ژلهاي پلي ساكاريدي غير دناتوره 8% در(nove x TBE ) 1 x TBE براي 50 دقيقه در ولتاژ 200V الكتروفورز مي شوند.همودوبلكس ها وهترودوبلكس ها بدنبال رنگ آميزي ژل با sybr greenII قابل رؤيت مي شوند.
تعيين توالي وبررسي فيلوژنيك : تعيين توالي نوكلئوتيدي amplicon هاي pcr m ژن بااستفاده از روش dye deoxy terminator انجام گرفت .
محصولات PCR m ژن بااستفاده از جفت پرايمر داخلي PCR amp227f و amp622r در 3/2 pmol/reaction تعيين توالي شدند. بررسي فيلوژنيك خوشاندي به دنبال تعيين توالي با استفاده از برنامه magaling4 انجام گرفت .

نتايج :

-تعيين ميزان حساسيت و اختصاصي بودن RT-PCRبراي m ژن: حساسيت تشخيص ويروس آنفولانزايA بوسيله روش RT-PCR براي Mژن با استفاده از سه ساب تيپ ويروس آنفولانزايA به نامهايsyd/97(h3n2) و dk/sing/97(h5n3) و Hk/1073/99(h9n2) انجام گرفت . رقتهاي سريال و متوالي از عصاره ويروسي تازه اين ويروسها در vtm تهيه گرديد. ازهررقتي، نوكلئتيك اسيدها براي سنتز cDNA و PCR جمع آوري شدند. به همين ميزان نيز به ارزيابي عفونت زايي اين روش ازهررقتي گرفته شد كه همان روز انجام گرفت در اين الگو ، رقت نقطه پايان براي عفونت زايي ويروس مي توانست مستقيماُ با نقطه پايان تشخيص RNA ويروسي بوسيله RT-PCR مقايسه گردد.
M ژن كه براي RT-PCR به كارمي رود 10pfu از ويروسهاي آنفولانزايA (H9N2 , H5N3 , H3N2) درميلي ليتر مي باشد .اين با حساسيت گزارش شده براي تشخيص ويروسهاي آنفولانزايA وB بوسيله روش NESTED RT-PCR بااستفاده از پرايمرهاي اختصاصي براي ژنهاي HAاز ويروسهاي آنفولانزايA وB مي باشد.RT-PCR براي ميزان توانائيش در تشخيص ويروسهاي آنفولانزايA از انواع حيوانات وميزاي اختصاصي بودنش براي ويروسهاي آنفولانزايA مورد آزمايش قرار گرفت .
يك محصولي با اندازه اي كه انتظار مي رفت (413bp) هنگامي كه ويروسهاي آنفولانزاي A مرغي ، انساني يا خوكي آزمايش شدند بدست آمد . اين نتايج نشان مي دهد كه توالي هاي mژن ويروسهاي آنفولانزاي A تمام حيوانات آزمايش شده را مي توان با پرايمرهاي ليست شده در جدول 2 تكثير كرد .يكسري محصولات نامعلوم PCR هنگامي كه ويروسهاي آنفولانزايB تست شدند مشاهده شدند ، كه دلالت بر اختصاصي بودن PCR براي توالي هاي ويروسهاي آنفولانزاي A مي كند .
تعيين مشخصات آمپليكونهاي Mژن بوسيله HMA وتأئيد توالي هاي آن :
بعد از تكثير Mژن بوسيله RT-PCR اختصاصي بودن محصول PCR براي هرويروس بامنشأ ميزباني خاص بوسيله HMA مورد تحقيق وتخصص قرارگرفت . اين كار با استفاده از بررسي طريقه فرم گرفتن هترودوبلكس بين آمپليكونهاي يك ويروس آنفولانزايA انساني رفرنس (bay/95) وآمپليكونهاي ويروسهاي مورد آزمايش از 15 ويروس آنفولانزاي A مختلف از ساب تايپهاي انساني و خوكي ومرغي صورت گرفت . (جدول شماره يك ) (نتايج در شكل 2 نشان داده شده اند)
هترودوبلكس هايي كه بين آمپليكونهاي سويه رفرنس (BAY/95) ومحصول PCR هر ويروس مورد آزمايش مشاهده مي شوند ، منعكس كنند تغيير توالي بين ويروس رفرنس وDNA ويروس مورد آزمايش مي باشد .
هيچ هترودوبلكسي در ستوني كه حاوي فقط محصول PCR رفرنس مي باشد مشاهده نمي شود .(lane 1,17) .كمترين كاهش در تغيير هترودوبلكس درجايي مشاهده مي شود كه محصول ويروس رفرنس (bay/95) با آمپليكون ويروس wuh/371/95 مخلوط گرديده است (lane 2) . هر دو ويروس bay/7/95 و wuh/371/95 از سويه هاي ويروس آنفولانزاي انسانيA ،H1N1 مي باشند .
بررسي توالي ها بر اين امر دلالت مي كند كه آمپليكونهاي Mژن ويروسbay/95 و wuh/371/95 تا 9/1% اختلاف دارند .
بنابراين آمپليكونهاي با بيشتر از 2% variation درتوالي نوكلئوتيدي بوسيله اين روش HMA مي تواند متمايز گردد .
هيچ اصلاحي در دوباره حل شدن باند وقتي كه 10% ، 20% ، يا گراديان ژلهاي پلي آكريل آميد استفاده شد مشاهده نشد . بيشترين ميزان كم شدن در تغيرپذيري در ستوني مه آمپليكون رفرنس از bay/95 با محصولات pcr ويروسهايي كه داراي mژنهاي ويروسي خوكي يا مرغي مخلوط شده اند مشاهده مي گردد .(ستون 3 و4 و7 تا 16). اختلافات نوكلئوتيدي بين آمپليكونهاي pcr از اين ويروسهاي مرغي وخوكي وويروس رفرنس انساني سويه bay/95 بوسيله بررسي توالي بين 5/14% و 4/21% مشاهده شد . (جدول 3) ميزان متوسط الگوي تغيير هترودوبلكس در مخلوطهاي حاوي آمپليكونهاي pcrاز ويروسهاي انساني (bay/95) H1N1 وويروسهاي انساني H3N2 تست و syd/97 و wuh/359/95 مشاهده شد (بترتيب ستون 5 و6) بررسي توالي ها يك اختلاف نوكلئوتيدي 7/6 تا 9/7 درصدي را بين ويروس H1N1 انساني و آمپليكونهاي mژن ويروس انساني H3N2 تست مشاهده شد .
ارزيابي يك الگوي رفرنسHMA براي تعيين انتقال بين گونه ها :
يك پانل از 9 و يروس آنفولانزاي A با ژنهاب M كه در دودمان انساني ، خوكي وطيور وجود دارند ساخته شد .
RNA از اينها و يك ويروس تست خالص سازي مي شود (HK/1073/99) و RT-PCR روي آن انجام مي گيرد .
آمپليكونهاي با اندازه اي كه اتنظار مي رفت (314bp) بوسيله ژل آگاروز الكتروفورز قابل رؤيت مي شود  يك قسمتي از هر آمپليكون رفرنس براي hma با محصول pcr ويروس تست (HK/1073/99) مورد استفاده قرار گرفت . (نتايج در شكل 3B نشان داده شده است ). بيشترين كاهش در تغيير پذيري هترودوبلكس هنگامي مشاهده شد كه آمپليكون HK/1073/99 با آمپليكونهاي ويروس انساني رفرنس مخلوط گرديد . كه دلالت بر فاصله زياد توالي Mژن ويروس مرغي با انساني دارد . هترودوبلكسهايي كه هنگام مخلوط كردن محصول PCR ويروس HK/1073/99 با آمپليكونهاي رفرنس مشتق شده از ويروسهاي خوكي و انساني تشكيل شدند الگوهاي تغيير پذيري گوناگوني را نشان دادند
بيشترين شباهت را با آمپليكون PCR ويروس مرغي QU/HK/GI/97 H9N2 مشاهده شد هيچگونه هتروبلكسي هنگامي كه آمپليكونهاي Qa/hk/gi/97 و hk/1073/99 مخلوط شدند مشاهده نشد كه دلالت بر كم بودن اختلاف اين آمپليكونها از ميزان حساسيت تست HMA دارد. نتايجHMA بوسيله تعيين توالي مستقيم آمپليكونهاي PCR ، Mژن از 9ويروس رفرنس وويروس تست تأئيد گرديد. بررسي توالي ها نشان داد كه اختلاف نوكلئوتيدي بين آمپليكونهاي Qa/hk/gi/97 و hk/1073/99 بميزان 1/1%مي باشد .

-بحث :

بيشترين شباهت را با آمپليكون PCR ويروس مرغي H9N2 Qa/HK/GI/97 , مشاهده شد  . هيچگونه هترو دوبلكسي هنگامي كه آمپليكونهاي Qa/HK/GI/97 و HK/1073/99 مخلوط شده اند مشاهد نشد كه دلالت بر كم تر بودن اختلاف اين آمپليكونها از ميزان حساسيت تست HMA دارد . نتايج HMA بوسيله تعيين توالي مستقيم آميليكونهاي PCR ، mژن از 9 ويروس رفرنس و ويروس تست تاييد گرديد . بررسي توالي ها نشان داد كه اختلاف توكلئوتيدي بين آمپليكونهاي Qa/HK/GI/97 و HK/1073/99 به ميزان 1/1% ازخوك يا طيور به انسان كم مي باشد اما چنين وقايعي مي توانند منجر به ميزان بالايي مرگ ومير مي شود واحتمال پديد آمدن ويروسهاي جهاني را به دنبال دارد .
تشخيص زود هنگام وتعيين خصوصيت واريانت هاي جديد آنفولانزا كه پديد آمده اند يكي از اهداف شبكه جهاني حفاظت درمقابل آنفولانزا سازمان بهداشت جهاني مي باشد .
از اين رو ، دست يابي به تستهاي سريع كه بتواند ويروسهاي جديد و غير معمول كه ممكن است داراي يك منشا به صورت مخزن حيواني باشند ضروري است . متدهاي سريع ، مانند ايمونوفلورسنس و enzyme immunoassay براي تشخيص ويروسهاي آنفولانزا در نمونه هاي كلينيكي به كار رفته اند .
گزارش شده كه روش ها داراي اختصاصيت وحساسيت متغيري هستند و مشخص نيست كه چگونه معرفهاي دخيل داراي توانايي معادل در تعيين ساب تايپهاي ويروسهاي آنفولانزاي حيوانات مختلف هستند . ارزش روشهاي PCR براي تشخيص ومحافظت ويروسهاي آنفولانزا در مواد كلينيكي بخوبي نشان داده شده است . روشهاي تكثير براي تشخيص و ساب تايپ كردن ويروسهاي آنفولانزاي A وبراي تفريق ويروسهاي آنفولانزاي A,B,C شرح داده شده است . ليكن اين روشها به طور اختصاصي براي تشخيص ، نگهداري ويروسهاي آنفولانزاي انساني طراحي شده اند وبيشتر احتياج است كه تستهاي سريع جهت تشخيص ويروسهايي كه ميزبان آنها موجوداتي غير از انسان هستند طراحي گردند ، اخيراً يك RT-PCR تك لوله اي بر پايه m ژن براي تشخيص ويروسهاي آنفولانزاي A مربوط به چند گونه شرح داده شده است .
دراين مطالعه ما يك متد توأم PCR-HMA را براي شناسايي وتعيين خصوصيت نسبي ويروسهاي آنفولانزاي A از گونه هاي مختلف طراحي كرده ايم .
ژنm1 بعنوان هدف انتخاب شد چراكه شواهد چنين پيشنهاد مي كنند كه m1 ORF در ميان ويروسهاي آنفلولانزاي A از گونه هاي مختلف ميزبان به ميزان زيادي حفاظت شده هستند. RT-PCR براي mژن نشان داده شده كه براي تشخيص ويروسهاي آنفولانزاي A ، 15 ساب تايپ مختلف با منشاء انساني ، مرغي وخوكي اخصاصي وحساس مي باشد . متدهاي بعد از تكثير براي بررسي تغيير توالي در آمپليوكنهاي PCR شامل بررسي RFLP ها و HAM ها مي باشد.
ارز يابيRFLP ، محصولات m ژن PCR براي ساب تايپينگ ويروسهاي آنفلانزاي A انساني و تفريق 6 ژن داخلي شامل m ژن ويروسهاي انساني H1N1,H3N2 , و ويروسهاي مرغي H5N1 شرح داده شده است . اشكال احتمالي تكنيك RFLP اين است كه موتاسيون در توالي نوكلئوتيدي آن مورد نظر ممكن است منجر به از دست دادن يا پديد آمدن باند شدن آنزيم محدود كننده شود . ميزان بالاي موتاسيون پذيري RNA ژنوم ها ، مانند ژنهاي ويروس آنفولانزا احتمال رخ دادن اين موتاسيونها را افزايش مي دهد .
از آنجائيكه كه بررسي هترودوبلكس نشان داد كه براي تفريق سريع ويروسهاي RNA دار بسيار مناسب مي باشد وبدليل اينكه سايتهاي مناسب آنزيمهاي محدود كننده كه ويروسهاي انساني ، مرغي وخوكي را متمايز مي سازد در آمپليكون 413 bp ژن m شناسايي شده اند ، HMA براي تعيين خصوصيات آمپليكون m ژن انتخاب شد .
HMA بر مشاهده تغييرات توالي بين آمپليكون هاي ويروس تست كه باعث پديد آمدن جفت نشدن درست با سويه رفرنس مي شود ودر نتيجه هترودبلكس ها متعاقباً دناتوره مي شوند ودوباره مي چسبند استوار است .
هتروبكلس ها آهسته از همودوبلكس هاي هم اندازه خود مهاجرت مي كنند وكاهش قابليت حركت متناسب با ميزان اختلاف بين دو توالي موجود درمخلوط دارد . درجه تغيير مورد نياز براي تفريق مناسب هترودوبلكس ها نشان داده شده كه بين طيف 25 و 5% مي باشد .
درجه اختلاف بين آمپليكونهاي m ژن مرغي ، خوكي ، وانساني بينابين طيف مي باشد وباعث تشكيل هترودولكس ها ي قابل تشخيص مي شود . 
شيفت در mobility هترودوبلكس مشاهده شد كه مرتبط با اختلاف بين DNA تست و رفرنس بود كه اختلافي به كمي 9/1 تا 1/1 % اختلاف توكلئوتيدي قابل تشخيص بود .
اين موضوع با گزارشات قبلي تعيين اختلاف 4 تا 4/1 درصدي قابل قياس بود . در اين كار بهترين تمايز بوسيله HMA هنگامي مشاهده شد كه محصولات اوليه PCR قبل از تكثير ثانويه رقيق شد .
از اين موضوع مي توان نتيجه گرفت كه هنگام آزمايش مستقيم نمونه هاي كلينيكي كه حاوي تيترهاي پائين تري از ويروس نسبت به مواد رشد كرده بر روي تخم يا سلول هستند اين كار ضروري نخواهد بود .
مناسب بودن متد PT-PCR HMA ما براي جستجوي نمونه هاي در يك شيوع بوسيله مقايسه يك تست ويروس با يك RAMEL ويروسهاي رفرنس ارزيابي مي گردد . سويه آنفولانزاي مرغي H2N2 ( HK/1073/99 ) بعنوان ويروس تست انتخاب گرديد چرا كه اين ويروس مرغي از يك بچه 4 ساله درهنگ كنگ جدا شده است.
يك ارتباط عالي بين نتيجه HMA و اختلاف نوكلئوتيدي وجود دارد براي تشخيص بوسيله تعيين توالي مستقيم وبررسي پلي ژنتيك آمپليکونهاي ويروس تست و رفرنس .
بوسيله HMA، آمپليكون PCR رفرنس مربوط به Qa/HK/GI/97 ارتباط دارد . اين ارتباط بر اساس گزارشات قبلي با 1% اختلاف توكلئوتيدي بين m ژنهاي HK/1073/99 , Qa/HK/GI/97 همراه مي باشد . درمجموع ، نتايج كار ما نشان مي دهد كه انجام توأم HMA,RT-PCR بر روي m ژن يك ابراز قوي براي تشخيص وشناخت ژنتيك ويروسهاي آنفولانزا مي باشد .HMA يك راه ساده وحساس براي جستجوي m ژنهاي ويروس هاي آنفولانزاي جدا شده مي باشد وفقط 36 تا 24 ساعت وقت لازم دارد . اگر چه متد RT-PCR HMA براي بررسي نمونه هاي دستگاه تنفس در اين مطالعه مورد استفاده قرار نگرفته ولي چنين نتيجه گيري مي شود كه اين متد مي تواند بطور مستقيم براي تست ويروسها در نمونه هاي كلينيكي به كار رود بدون اينكه ضرورتي به رشد ويروس اول بر روي سلولهاي محيط كشت يا جنين تخم مرغ باشد .
حساسيت روش m ژن RT-PCR كه شرح داده شد قابل قياس با حساسيت روش RT-PCR كه در آن از پرايمرهاي اختصاصي ژنهاي HA ويروسهاي آنفولانزاي B,A براي تعيين ويروسهاي آنفولانزاي B,A به طور مستقيم درنمونه كلينيكي مي شود . ويروسهاي آنفولانزاي جديد وغير معمول را كه بوسيله HMA شناسايي شده اند مي توان بسيار وسيعتر بوسيله تعيين توالي مستقيم و HI تايپينگ شناسايي وتعيين خصوصيت كرد . پانل HMA ويروس رفرنس را كه ماساختيم نياز خواهد داشت كه با اطلاعات بدست آمده از ويروسهاي كه در بين انواع حيوانات درچرخش است به روز شود . سرانجام ، تكنيك تركيبي RT-PCR هترودوبلكس مي تواند براي شناسايي ديگر ژنهاي داخلي ويروس آنفولانزا بكار رود .

بيماريزاي عصبي ويروس آنفولانزاي H5N1ژنوتيپ جدا شده از طيور هنگ كنگ در 2001 در موش
خلاصه :

ما پاتوژنسيته 5 ژنوتيپ مختلف ( E تا A ) را از ويروسهاي آنفولانزاي مرغي H5N1 مطالعه كرديم كه حاوي ژنهاي HA مشابه ويروس H5N1 A/goose /Guangdong/1/96 و 5 تركيب مختلف ژنهاي داخلي در يك مدل موشي مي باشد . واريانت هاي نوروتوپيك وبسيار پاتوژن ويروس از ژنوتايپهاي A,C,D,E از مغز بعد از يك پاساژ داخل بيني در موش جدا شدند . ژنوتيپ ويروس B فقط از ششها جدا شدند .واريانت هاي مغز موش داراي آمينواسيدهاي تغيير يافته در محصولات تمامي ژنهايشان بجز پروتئين هاي PB1,NP,NS1 بودند اما شامل موتاسيونهاي معمول نبودند . ما نتيجه گرفتيم كه منشاء ژنوتيپي H5N1/01 از A,C,D,E بصورت هتروژنوس مي باشد وديگراينكه ورايانت هاي بسيار پاتوژن نوروتروپيك مي توانند سريعاً در موش انتخاب شوند .

مقدمه :

شيوع ويروس آنفولانزاي A,H5N1 در هنگ كنگ در سال 1997 ، 6 نفر از 18 نفري را كه عفوني شده بودند از بين بردواولين مورد مستند انتقال مستقيم ويروس آنفولانزاي مرغي از طيور به انسان بود .
شيوع منجر به گسترش بيماريهاي جدي كشنده شد وبعضي به آن بعنوان نخستين حالت پاندميك اشاره مي كنند .
كشتار تمام طيور در فروشگاههاي فروش طيور زنده در هنگ كنگ در دسامبر 1997 باعث از بين رفتن منبع عفونت و جلوگيري از انتقال بيشتر به انسانها شد . ويروسهاي H5N1 انساني جداشده (/97 H5N1 ) تصور مي شود كه بطور طبيعي از نوترتيبي ويروس هاي مرغي پديد آمده اند كه ژن ( HA ) هماگلوتينين بسيار با اين ژن در ((A/goose/Guangdong/1/97(H5N1))) همولوگ مي باشد وكمپلكس همانند ساز آن بميزان زيادي با كمپلكس مانند ساز يروسهاي (H9N2)A/guail/Hongkong/GI/97,(H6N1)Alteal/Hongkong/W312/97 مشابه مي باشد .
ژن نورآمينيداز (NA ) ويروس H5N7/97 همچنين بطور نزديك با اين ژن در ويروس Alteal/Hongkong/W312/97 همولوگ مي باشد .
در طول سالهاي 1999 و2000 ويروسهاي H5N1 شبهGO/Gd به خرچه زندگي خود در غازها درجنوب غربي چين ادامه دادند . اين ويروسها با ويروسهاي با منشاء مرغان آبي نوتركيبي داشتند وژنوتيپهاي چندتايي ويروسهاي H5N1 حاوي ژنهاي NA,HA از ويروسهاي شبه GO/Gd در فروشگاههاي طيور هنگ كنگ بين فوريه وMay 2001 دوباره ظاهر شدند.
اين ظهور دوباره ويروسهاي H5N1 در پرندگان خاكي اولين بار بود كه بعد از اپيدمي دسامبر 1997 رخ مي داد ومنتج به دومين ميزان تلفات در طول 4 سال زندگي طيور درهنگ كنگ خصوصاً‌در ناحيه اجرائي گرديد. تمام ويروسهاي H5N1 جداشده از طيور در فروشگاههي خرده فروش طي زمستان وبهار 2001 نوتركيبهايي بودند كه حاوي ژنهاي NA,HA در درمان GO/Gd وژنهاي داخلي ديگر ويروسهاي مرغان آبي بودند .
5 نوع از نوتركيب ها با ژنوتايپهاي طراحي شده A,B,C,D,E مشاهده شدندد وبا توجه به منشأ فيلوژني وساختار ژنهاي داخلي گروه بندي شدند . ويروسهاي تمام 50 ژنوتيپ شديداً‌ براي جوجه ها وبلدرچين ها بيماريزا بودند همچنين تمام 5 ژنوتيپ براي موش هنگامي كه با دوزبالا باويروس عفوني تلقيح مي شدند كشنده بودند . ويروسهاي 4تااز 5 ژنوتيپ ازمغز موشهايي كه علائم اختلال سيستم عصبي مركزي CNS را داشتند جدا شد. پاتوژنيسته ويروس آنفولانزاي A در موش معمولا نياز به آداپته شدن با ميزبان جديد ، كه طي رشد چند نسل پي درپي « پاساژهاي پشت سرهم » ويروس در مغز يا ششها رخ مي دهد .
مطالعه كسب بيماريزايي در طول آداپته شدن در موش نشان داد كه ويروسها آداپته شده با موش كه پنموويرولانس و نوروويرولانس هستند نشان داده كه با موتاسيون در NS,M,NA,NP,HA يك يا ده تا از ژنهاي پلي مراز همراه مي باشد .
برخلاف ديگر ويروسهاي آنفولانزاي A مرغي وانساني ، سويه هاي مرغي و انساني هنگ كنگ H5N1/97 جدا شده داراي پاتوژنيسته درموش مي باشند بدون آداپته شدن . ويروسهاي H5N1/97 در پاتوژنسيته براي موش هتروژنوس هستند : تعدادي از جداشده ها بسيار بيماريزا بودند و بصورت سيستميك تكثير مي كردند درحالي كه ديگران داراي بيماريزايي كمتري بودند ودر دستگاه تنفسي تكثير مي كردند . پاتوژنز ويروسهاي H5N1/97 درموش از ديگر ويروسهاي شديد غيرپاتوژن H5 متمايز مي باشد وشماي ملكولي فتوتيپهاي H5N1/97 كه در موش بسيار پاتوژن هستند تعيين شده اند . بعلاوه ، Hatta وهمكارانش با استفاده از تكنيكهاي معكوس ژنتيكي بر پايه پلاسميدنشان دادند كه وجود يك ليزين در بنيان 627 در پروتئين PB2 ويك محل شكست پلي بازيك در HA براي بيماريزايي شديد و تكثير سيستميك ويروس (H5N1)A/Hongkong/483/97 درموش قطعي مي باشد .
پاتوژسيته فتوتپهاي كم و بسيار پاتوژن دريك مدل موش صحرائي عقيم مورد مطالعه قرار گرفته است : هر دوفتوتيپ شديداً در موش صحرائي بيماريزا بودند بر خلاف بيماريزايي متفاوتي كه درموش ديده مي شد .
پاتوژنسيته ويروس (H5N1 ) A/Hongkong/156/97 انساني مورد مطالعه قرار گرفت . اين ويروس بطور كارآمد در دستگاه تنفسي تكثير مي كند وقطعات ژني بوسيله PCR درمغز وتعدادي ارگانهاي داخلي عفوني شده تشخيص داده شدند اما هيچ گونه تكثير سيتسميك دراين ويروس مشاهده نشد .
درمطالعات فعلي ، ما از يك مدل موش براي تعيين خصوصيات پاتوژنسيته 5 ژنوتيپ ويروسهاي H5N1 2001 هنگ كنگ درميزبانهاي پستاندار استفاده كرديم . ويروسهاي 4 ژنوتيپ از 5 ژنوتيپ بعد از تلقيح به داخل بيني از مغز موش جدا شدند . ما بيماريزايي را براي موش وشماي ملكولي اين واريانت هاي نوروپاتيك موجود در مغز موش (MB) را با ويروس جدا شده با منشاء H5N1/01S را مقايسه كرديم نتايج دال بر تاثير ژنهاي داخلي بر روي پاتوژنسيته ويروسهاي H5N1 مرغي در ميزبانهاي پستاندار و احتمالاً انتخاب سريع واريانت هاي بسيار پاتوژن و نورويرولانت مي باشد .

ويروسها :

ويروسهاي 5 نوع H5N1 مرغي ، از هر 5ژنوتيپ كه در بهار سال 2001 در هنگ كنگ جدا شدند در اين مطالعه مورد استفاده قرار گرفتند.
Genotype A,A/chicken/Hongkong/yu822.2/2001(ch/hk/yu822.2/01)
Genotype B,A/chicken/Hongkong/yu562/2001(ck/hk/yu562/01)
Genotype C,A/pheasant/Hongkong/Fyl55/2001(ph/HK/Fy155/01)
GenotypeE ,A/Chicen/Hongkong/NT87303/2001(CK/HK/NT87303/01).
ويروسها بوسيله يك پاساژ در جنين تخم مرغ جدا شدند . براي آماده سازي استوكها براي مطالعه درموش ، ويروسها قبلا براي يك بار بيشتر در حفره آلانتوئيك جنين 10 روزه جوجه براي 48تا40 ساعت در دماي c370 پاساژ داده شدند .
مايع آلانتوئيك حاوي ويروس خالص سازي شدند وميزان عفونت زائي آنها در تخم مرغ ها تيتر شد . تيترهاي ويروس بعنوان log10 -50% از دوز عفوني كننده تخم مرغ در ml1/0 از مايع بيان مي شد . (log10 50% EID50 per0.1 ml) با توجه به متد Reed , Muench . استوكهاي ويروس به دو دسته زنده وتازه و دسته نگهداري شونده در 80- تا موقع مصرف تقسيم بندي شدند .
تمام مطالعات با ويروسهاي H5N1 در سطح +3 ، Biosafty انجام گرفت آزمايشگاه توسط بخش كشاورزي ايالت متحده دراختيار محققين گذارده شد .

بيماري زائي وتمايل بافتي ويروس H5N1 اصلي جدا شده از موش :

موش ماده 5/1 ماهه BALB/C براي اين مطالعات مورد استفاده قرار گرفتند . براي تعيين 50% دوز كشنده در موش ( MLD50) ، 4گروه ازموشها بوسيله استنشاق ايزوفلوران بيهوش شدندوبا ml 1/0 از مايع آلانتوئيك در سالين بافرفسفات بصورت تلقيح داخل بيني عفوني شدند (PBC ) « 10 رقت پشت سرهم از تا حيوانات روزانه وزن شدند و براي 20 روز تحت نظر گرفته شدند .
تيتراسيون MLD50 نشان داد كه تمامي 5 ژنوتيپ ويروسهاي H5N1/01 از گروه داراي پاتوژنسيته كم در موش بودند به همين دليل آنها بطور قابل توجه اي ايجاد بيماري ومرگ ومير فقط در روز بالا ايجاد مي شد .« جدول 1»
بدليل اينكه ويروسها داراي ارزشهاي EID50 مشابه بودند مارقت از مايع آلانتوئيك را كه حاوي تقريباً از ويروس به عنوان دوز عفوني براي مطالعات بيشتر بر روي پاتوژنسيته انتخاب شدند . گروههاي 18 تا 26 موش ها با ml 501 از مايع آلانتوئيك رقيق شده با PBS بصورت داخل بيني مورد تلقيح قرار گرفتند .
3 موش از هر گروه در روزهاي 3و7 بعد از تلقيح براي تعيين تيتر ويروس در ريه كشته شدند « روز 3 » ودر مغز و ارگانهاي داخلي « روز 3و7» .
موش باقي مانده در هر گروه بصورت روزانه وزن شدند وبراي 20 روز تحت جهت مشاهده علائم بيماري ومرگ ومير تحت نظر گرفته شدند .
شش ها ، مغز ، طحال ، كبد ، كليه ، وقلب هر موش مرده يا حيواناتي كه مرحله پاياني بيماري كشته مي شدند خارج شدند . ارگانها در PBS سرد شسته شدند ، وزن شدند، له شدند ودر PBS سرد با آنتي بيوتيكها براي به دست آوردن يك هموژن 10% هموژنيزه شدند . ناخالصي هاي نمك بوسيله سانتريفيوژ كردن درz,000 g براي 10 دقيقه ته نشين شدند .
بافت هموژن نشده به درون حفره آلانتوئيك جنين 10 روزه تخم مرغ تشخيص محدوده پائين تر ويروس 0.1log10 EID-DO/0.1ml از بافت هموژن مي باشد .
3تا7 روز بعد از تلقيح هيچ ويروسي در مغز يا ارگانهاي داخلي موش قابل تشخيص نبود. ليكن ويروس در مغز وارگانهاي داخلي موش كه علائم نورولوژيك را نشان مي داد 8تا10 روز بعد از تلقيح قابل تشخيص بود « بطور عمده فلج پاي عقب »
نتايج بررسي پاتوژنسيته وبافت گرايي 5 ژنوتيپ H5N1/01 را به سه گروه تقسيم مي كند . گروه اول شامل ويروسهاي ژنوتيپهاي A,B هستند كه ابتدا در ريه هاي موش همانند سازي مي كنند . عفوني شده با ويروس CK/HK/YU822.2/01 ، ويروس از شش ها ، مغز وارگانهاي داخلي جدا شده ويروس به ميزان كافي درمغز اين حيوان همانند سازي كرده بود . تيتر ويروس CK/HK/YU822.2/01در كبد ، طحال وكليه خيلي پائين بود .
« ويروس فقط از بافت هموژن رقيق نشده جدا شد .» ويروس ژنوتيپ B فقط درشش هاي موش عفوني قابل تشخيص بود . عفونت با اين ويروس باعث 55% مرگ ومير گرديد. گروه دوم متشكل از فقط يك عضو بود . ph/HK/FY155/01 ( ژنوتيپ c) ، كه در شش ها ومغز عفوني موش همانند سازي مي كند .
عفونت با اين ويروس منتج به بيشتر ميزان مرگ ومير گرديد . اين ويروس از مغزهاي موش كه داراي فلج پيشرفتهاي عقبي بود وتلف شده بود يا اينكه در روزهاي 7تا10 بعد از تلقيح كشته شده بود جدا شد .29% از حيوانات تلف شده « 7/27 % از عفوني ها » داراي ويروس درمغز بودند .
ويروس ژنوتيپ c در شش ها ومغز موش با تيترمشابه اي ، كه حداكثر ميزان را نسبت به بقيه ژنوتيپ ها داشت همانند سازي كردند.
گروه سوم ، شامل ويروسهاي ژنوتيپ D,E كه همچنين در شش ها مغز موش عفوني تكثير مي كنند باشد اما بيشتر از ژنوتيپهاي ديگر نوروتروپيك هستند ، تمام موشهايي كه بعد عفوني شدن بااين ويروسها مردند داراي ويروس در مغز بودند . نرخ مرگ ومير موش عفوني شده با CK/HK/FY150/01 « ژنوتيپ D »
و CK/HK/NT873.3/01بترتيب 5/61% و 3/33% مي باشند . موش هاي عفوني شده با ويروسهاي ژنوتيپ E,D دچار فلج پاي عقبي ، paresis , tremors قبل از مرگ در 10 تا 14 روز بعد از تلقيح مي شدند .

پاتوژنسيته وتمايل بافتي واريانت هاي H5N1 جدا شده از مغز موش :

واريانت هاي نوروتروپيك ويروسهاي اصلي ژنوتيپهاي A,C,D,E « واريانت MB» از مغز بوسيله كشت مغز هموژن ويروس مثبت در تخم مرغ جنين دار 10 روزه با يك با پاساژ جدا سازي شدند .
ارزش EID50 , MLD50 همانطور كه در بالا شرح داده شد تعيين گرديد . براي مطالعه پاتوژنسيته وتمايل بافتي ، گروههايي متشكل از 4 حيوان بصورت درون بيني با ml 1/0 از مايع آلانتوئيك رقيق شده باPBC حاوي تا از ويروس عفوني مورد تلقيح قرار گرفتند .
مغز ، شش ها و ارگانهاي داخلي موش كه مرده بود يا در مرحله پاياني بيماري كشته شده بود خارج شدند .
واريانت هاي CK/HK/YU822.2/01 , MB, Ph/HK/FY155/01 –MB, CK/HK/FY150/01 –MB , CK/HK/NT87303/01 –MB طراحي شدند بطور قابل توجه اي از ويروسهاي اصلي بيماريزاتر بودند . اين واريانت ها ارزش MLD50 مشابه با ارزش EID50 آنها داشت كه دلالت بر پاتوژنسيته بالاي اين ويروسها براي موش دارد . واريانت هاي MB با توجه به تمايل بافتي شان دريكي از دو گروه قرار مي گيرند .
گروه اول شامل واريانت هاي با پاتوژنسيته بالا از ژنوتيپهاي A,C مي باشد كه بصورت سيستمتيك تكثير پيدا مي كنند و مغز وارگانهاي داخلي را عفوني مي سازند . دوزهاي بسيار عفوني كننده از اين واريانت هاي MB منتج به مرگ در روزهاي 3و5 شده ،‌دوزهاي پايين تر موشها را 6 تا 11 روز بعد از تلقيح مي كشد . تلقيح با دوزهاي تا از هر دو ويروس سبب ايجاد علائم نورولوژيك مانند فلج پاهاي عقبي ، tremor , paresis گرديد.
تيتر ويروس واريانت MB از ژنوتيپ هاي A,C در كبد و طحال وكليه وقلب حداقل log102 تا 5/3 پايين تر از تيتر آنها در شش ها ومغز بود ، جايي كه واريانت ها بطور كافي همانند سازي مي كنند . اين نتيجه پيشنهاد مي كند كه اين واريانت ها ي MB پنموتروفيك ونوروتروفيك هستند .
گروه دوم شامل واريانت هاي MB از ژنوتيپ E,D هستند كه فقط در شش ها و مغز موش هاي عفوني تشخيص داده شده اند .
واريانت ژنوتيپ D موش را 4تا8 روز پس از تلقيح مي کشدوميزان EID5025/1 10از وريروس عفوني باعث فلج پاهاي عقب و Paresis در روزهشتم بعد از تلقيح مي شود . واريانت MB از ژنوتيپ Dدر شش ها ومغز تمامي موشهاي مرده يا كشته شده تشخيص داده شدند .
پاتوژنسيته CK/HK/NT873.3/01- MB « ژنوتيپ E» مشابه با واريانت ژنوتيپ D مي باشد ، بيشتر حيوانات در روز نهم مردند وعلائم نورولوژيك درموش عفوني شده با دوزهاي 25/3 10 و 25/2 10 و 25/1 10 EDI56 مشاهده شد . ويروس ژنوتيپ E از شش ومغز هر حيوان تلف شده يا كشته شده جدا شد . تيترهاي واريانت هاي ژنوتيپ درشش ها ومغز مشابه بودند .

بررسي هيستوپاتولوژيك :

با تغييرات لوكاليزه پاتولوژيك در CNS باعث بروز علائم نورولوژيك مي گردد ، نمونه هاي مغز وطناب نخاعي موش عفوني شده با CK/HK/YU822.2/02 – MB
« ژنوتيپ A» وموشهايي كه درمرحله پاياني بيماري از بين رفتند در بافرخنثي فرمالين 10% فيكس گرديدند ، درواكس پارافين تثبيت شدند ، برشهاي 5 زده شدند ، با هماتوكسيلين وائوزين رنگ شدند و براي تغييرات هيستوپاتولوژيكال مورد ارزيابي قرار گرفتند.
دژنره شدن نرونها ونوروفاژيا با التهاب در اثر فيلتر نشدن گلرانولوسيتها وسلولهاي مونونوكلوئر به ناحيه ساقه مغز و طناب نخاعي محدود مي شد .
انفيلتراسيون سلولهاي منونوكلوئر همچنين در مننژها و در فضاهاي Prevascular ساقه مغز و neuropil طناب نخاعي ديده مي شود .
در طناب نخاعي ، همچنين يك دژنره شدن معمول سلولهاي گليال را داريم ونرونهاي با كروماتين هاي حاشيه اي ويك انكلوژن ائوزينوفيليك كه به طور نسبي يا كاملا هسته را پر مي كند . دژنراسيون نروني و انفيلتراسيون التهابي همچنين در تعدادي از ريشه هاي dorsal گانگليا مشاهده شد وتعداد زيادي از كانونهاي نكروزه وسلولهاي التهابي به همراه بافت تخريب شده مشاهده گرديد.

مرفولوژي پلاك :

يكي از خصوصيات مهم ويروسهاي آنفولانزا در توانايي تشكيل پلاك در سلولهاي كشت داده شده مي باشد . همانند پاتوژنسيته ، اين خصوصيت مي تواند طي انتخاب شدن در موش تغيير پيدا كند . مرفولوژي پلاك مي تواند منعكس كننده هتروژنسيتي جمعيت ويروسي باشد . ارزيابي پلاك در سلولهاي MDCK همانطوري كه در قبل شرح داده شد انجام مي گيرد . ويروسهاي با منشاء ژنوتيپ هاي A,B,C,D تشكيل پلاكهاي بزرگ را كه بخوبي قابل تشخيص مي باشد مي دهند كه اين از خصوصيات ويروسهاي آنفولانزاي مرغي بسيار پاتوژن مي باشد . ويروس ژنوتيپ ( CK/HK/NT873.3/01 ) E پلاكهاي كوچك و كدر را تشكيل مي دهد.
پلاكهايي كه بوسيله ويروسهاي با يك منشاء تشكيل مي شود هموژنوس بودند . پلاكهايي كه بوسيله واريانت هاي MB تشكيل مي شدند بزرگترازآنهايي بودند كه بوسيله منشاء تشكيل مي شد و واريانت MB ژنوتيپ (CK/HK/NT873.3/01 – MB ) پلاكهايي را تشكيل مي دهند نسبت به پلاكهاي ويروس منشاء بهتر شناسايي شده است . هيچ پلاكي مانند آنهايي كه بوسيله واريانت هاي MB در سلولهاي MDCKعفوني شده با ويروس هاي منشاء مشاهده مي گردد تشكيل نمي شود .
افزايش مشابه دراندازه پلاك در واريانت هاي MB ژنوتيپهاي C,D مشاهده گرديد .

مقايسه توالي هاي ويروسهاي منشأ و واريانت هاي MB

مطالعات در موش نشان مي دهد كه تلقيح منشاء ويروسهاي H5N1/01 جداسازي شده از ژنوتيپ هاي A,C,D,E درموش منتج به انتخاب واريانت هاي بسيار پاتوژن وعصب دوست مي شود . با مقايسه تمام ملكول ايزوله هاي منشاء و واريانت هاي MB و تعيين اساس ملكولي بيماريزاي در موش وتمايل به عصب ، تمام ژنهاي پديد آورنده واريانت هاي MB تعيين توالي شدند .
RNA ويروسي از مايع آلانتوئيك حاوي ويروس با استفاده از RNeasyminikit جدا سازي شد . پرايمر uni-12 براي نسخه برداري معكوس مورد استفاده قرار گرفت .
PCR با دسته اي از پرايمرهاي عمومي كه براي قطعات ژني ويروسهاي آنفولانزاي A اختصاصي مي باشد انجام شد . محصولات PCR با كيت خالص سازي سريع PCR (QIA ) خالص سازي شدند. عمليات تعيين توالي و بررسي نمونه ها درمركز بيوانفورماتيك وبيوتكنولوژي Harwell در بيمارستان تحقيقاتي كودكان St.Jvde انجام گرفت . تعيين توالي DNA كامل شد ، ويرايش شد ، ترجمه گرديد وبا استفاده نرم افزار بررسي توالي به نام Lasergene بسته بندي گرديد .
بررسي فيلوژنيك توالي هاي كل ژنوم از ژنهاي واريانتهاي MB H5N1/0 ، ويروس منشاء و CK/HK/YU562/01 ( ويروس ژنوتيپ B كه از مغز موش جدانشده بود) نشان داد كه ايزوله هاي منشاء داراي همان پراكندگي مشابه 5ژنوتيپي هستند همانطوري كه قبلاً براساس تعيين توالي نسبي توالي مشاهده شده بود .
واريانت هاي متمايل به عصب جدا شده از مغز موش متعلق به دسته مشابه اي از ژنوتيپها بود همانطوري كه در ابتدا درموش به طريقه داخل بيني تلقيح شده بود.
تغييرات توالي هاي آمينواسيدي بين ويروس هاي original و واريانت هاي MB آنها با آنهايي كه بين فنوتيپهاي موش H5N1/97 انساني با پاتوژسيته بالاوپايين يافت ميگرد مقايسه گرديد. تغييرات آمينواسيدي در واريانت هاي بسيار پاتوژن در تمام محصولات ژني وجو داشت بجز پروتئين هاي NS1,NP,PB1 بيشترين تغييرات ويروسهاي original رااز واريانت هاي MB متمايز مي ساخت ، همانطور كه از ديگر ويروسهاي با پاتوژنسيته بالاو پايين تمايز مي ساخت وآنها منحصر به فردنبودند . طبيعت اتفاقي اين تفاوتها پيشنهاد مي گردد كه ويروسها هتروژنوس هستند ودلالت مي كند براينكه احتمال انتخاب سريع واريانت هاي بسيار پاتوژن وجود دارد .
اين پيشنهادات بوسيله هتروژنسيته توالي هاي original از ژنهاي PA,PB2 تاييد مي شود بخصوص در ژنوتيپ هاي A,C,D . واريانت MB از ژنوتيپ A(CK/HK/YU822.2/01 – MB ) از ويروس original بوسيله تغييرات منحصر به فرد در بنيان 738 در PB2 پلي مراز ، بنيان 10 و 212 در PA پلي مراز ، بنيان 50 در HA وبنيان 86 در NS2 وبوسيله حذف 20 آمينواسيدوجانشيني G به جاي S70 در NA متمايز شدند . واريانت MB از ژنوتيپ C داراي 4 آمينو اسيد منحصر به فرد بودند كه در موقعيت هاي 305 و 307 و 627 در PB2 ودر موقعيت 501 در PA در واريانت MB از ژنوتيپ D يك جانشيني منحصر به فرد در بنيان 97 در PA وجود دارد در حاليكه واريانت MB از ژنوتيپ E داراي چنين تغييراتي نبود . اين موتاسيونهاي منحصر به فرد ممكن است در اكتساب بيماريزاي بالا و بيماري زاي براي عصب در واريانت هاي MB دخيل باشند .
عدم وجود چنين تغييرات منحصر به فردي در واريانت MB از ژنوتيپ E مي تواند در ابتدا بوسيله نوروتروپيسم بالا وبيماريزائي پايين ويروسهاي original جدا شده از موش شرح داده شود. تغييرات متعاقب در واريانت MB ممكن است داراي اثر بيماريزائي داشته باشد ولي اثر نورويرولانس ندارد .
ويروسهاي H5N1 هنگ كنگي مرغي وانساني كه در سال 1997 جدا شده اند داراي ژنوتيپهاي مشابهي هستند :
هتروژنيستي پاتوژنسيته آنها درموش نتيجه يك اختلاف كوچك در تواليهاي ژنومهاي ويروسي بود . در مقابل ويروسهاي H5N1 جدا شده از فروشگاههاي طيور هنگ كنگ ر سال 2001 از 5 ژنوتيپ مختلفي كه به طور طبيعي وجود داشتند بودند . اين ويروسهاي H5N1/97 و H5N1/01 به طور معمول فقط داراي ژن NA « كه از نظر فيلوژنيكي نزديك به ويروسهاي شبه GO/Gd مي باشند » ويروسهاي شبه GO/Gd كه در سال 1999 در هنگ كنگ جدا شدند. جدژنهاي HA,NA وتعدادي از ژنهاي دروني ويروسهاي H5N1/01 بودند كه نشان داده شده داراي بيماريزايي كمي درموش بوده اند : اين ويروسها به طور موثر در ششهاي موش همانند سازي مي كردند وفقط يكي از آنهايي كه جدا شدند ومورد مطالعه قرار گرفته اند به ميزان خيلي كم درمغز رديابي شده اند مافهميديم كه بيشتر ويروسهاي H5N1/OS original همانند ويروسهاي H5N1/99 شبه GO/Gd داراي پاتوژنسيته كمي در موش بودند وبه بافت عصب نيز تمايل داشتند . ليكن بر خلاف ويروسهاي شبه GO/Gd ويروسهاي H5N1/01 چها تار از 5 ژنوتيپ A-E در مغز موش قابل تشخيص بودند . زخمهاي اختصاصي ويروس در ساقه مغز وطناب نخاعي وجراحات التهابي ريشه هاي بالايي گانگليا دلالت مي كند بر اينكه اين واريانتهاي MB نوروتروپيك از ششها به مغز به طريق انتقال سيناپسي بوسيله اعصاب حسي منتشر مي شوند .يك مسير انتقال عصبي ويروس هم همچنين در موش عفوني شده با ويروسهاي مرغي H5N3 كه درجوجه ها اداپته و بسيار بيماريزا شده بودند ، مشاهده شد . ويروس ژنوتيپB به طور موثر در ششهاي موش همانند سازي مي كنند و سبب مرگ ومير مي شوند . اما درمقابل ويروسهاي ژنوتيپ A,C,D,E ويروس ژنوتيپ B از مغز جدا نشد . تلقيح موش با واريانتهاي MB جدا شده از مغز نشان مي دهد كه اين واريانتهادر موش بسيار بيماريزا هستند وحداقل داراي بيماريزاي مشابه در موش هستند همانطور كه ويروسهاي H5N/97 با فتوتيب بسيار بيماريزا اين كار را انجام مي دهند . انتخاب واريانت نوروتروپيك از 5 ژنوتيپH5N1/01 طي تكثير در موش سريع به وقوع مي پيوندد واريانتهاي MB بسيار پاتوژن فقط طي يك پاساژ ويروس توليد مي شوند. چنين انتخاب سريعي احتمالاً بوسيله اقامت طولاني غير معمول اين ويروسها در ششها امكان پذير مي گردد «ما اين ويروس را از ششهاي موش در روزهاي 8 تا 12 بعد از تلقيح جدا كرديم . » يافته هاي ما دلالت مي كند براينكه ارقام ژنهاي داخلي در ويروسهي H5N1/97 كه از چرخه حيات بوسيله كشتار تمامي طيور در سال 1997 خارج شد .
فقط تركيب ژنها نبود كه منبع به پاتوژنسيته بالاي اين ويروس در طيور وپستاندران شد : قطعات مختلف چندتايي ژن داخلي ويروسها كه به طور رايج درجنوب شرقي چين درچرخه هستند مي توانند كامل بكنند ژن HA ويروس شبه GO/Gd براي توليد ويروسهاي كه بسيار بيماريزا هستند و در ميزبان پستاندار خاصيت نوروتروپيك دارند. بنابراين HA ويروسهاي شبه GO/Gd كه داراي سايتهاي برش چندتايي هستند ممكن است يك نقش كليدي را در بيماريزاي ويروسهاي مرغي H5N1 هنگ كنگي در گونه هاي پستاندران فقط هنگامي كه بوسيله يك تركيب مناسب با ژنهاي داخلي كامل شوند ايفا كنند .
ويروس ژنوتيپ A ازنظر داشتن ژنهاي PA,M از رده فيلوژنيك شبه GO/Gd با ژنوتيپ B متفاوت است. ژنوتيپهاي C حاوي ژنهاي NP,BP1 از ويروسهاي شبه GO/Gd است كه اين ژنها ژنوتيپ C را از ژنوتيپ A,B متمايز مي سازد.
ژنوتيپ هاي D,E فقط در ژن NP شان با همديگر وباژنوتيپ C فرق مي كند ويروس ژنوتيپ B حاوي ژنهاي HA,NA اي است كه از نظر فيلوژني به ويروسهاي شبه GO/Gd نزديك مي باشد اين ژنها باعث مي شوند كه اين ويروسها در رده پرندگان وحشي دريايي ناشناخته باقي بمانند . ما پيشنهاد مي كنيم كه جمعيت ويروسي ژنوتيپ B هموژنوس مي باشد . چرا كه هيچ واريانت بسيار پاتوژني از اين ژنوتيپ طي يك پاساژ در موش انتخاب نمي شوند . ژن HA از ويروس ژنوتيپ B كه داراي سايتهاي برش چندتايي كه از ويروسهاي شبه GO/Gd منشاء گرفته اند به تنهايي كافي نيستند . تا معرف يك ويروس با بيماري زايي بالا و نوروتروپيسم در موش حداقل طي يك پاساژ باشد .
درمقابل جمعيت ويروس ژنوتيپ B جمعيتهاي ويروسي ژنوتيپ هاي A,C,D,E هتروژنوس هستند چرا كه يك پاساژ از اين ويروسها درموش منجر به انتخاب واريانتهاي بسيار پاتوژن مي شوند . مقايسه توالي ها بين واريانتهاي MB وفتوتيپ ويروسهاي H5N1/97 هنگ كنگي كه براي موش بسيار پاتوژن هستند و ويروسهاي اداتپه شد . با موش هيچ گونه از سريهاي معمول موتاسيونها را نشان نمي دهد .
فقط جانشين K به جاي E627 در PB2 در واريانت MB ژنوتيپ C كه مشاهده شده مشابه موتاسيون بود كه مسئول بيماريزايي بالايي ويروس HK/483/97 بود اما اين موتاسيون فقط در ويروس ژنوتيپ C يافت مي شد . فقدان يكسري موتاسيونهاي رايج در واريانتهاي بسيار پاتوژن و نوروتروپيك پيشنهادمي كندكه راههاي مختلف زيادي براي ويروسهاي آنفلونزاي H5N1/01 هنگ كنگي براي دستيابي به بيماري بالاونوروتروپيسم در موش وجود دارد . شرط لازم براي نوروويرولانس ويروسهاي H5N1/01 هنگ كنگي درموش وانتخاب سريع فنوتيپ هاي بسيار پاتوژن در ميزبان جديد ممكن است به دليل شكل گيري ويژه كمپلكس ژنهاي همانندساز باشد .
محلهاي برش چندتايي در HA ضروري مي باشد . اما براي اينكه اين ويروسها را بسيار پاتوژن ونوروويرلانت در موش باشد كافي نمي باشد ، تغييرات اختصاصي در پروتئينهايPA,PB2 پلي مراز در اين فرايند دخيل هستند بنابراين ما حدس مي زنيم كه انتخاب واريانتهاي بسيار پاتوژن نوروتروپيك طي نوترتيبي طبيعي بوسيله بالا رفتن هتروژنسيته ويروسي از اضافه شدن ژنهاي PA « ژنوتيپ A و PB2 « ژنوتيپهاي C,D,E» از منشاء شبه GO/Gd به زمينه كمپلكس همانند ساز از يك رده فيلوژني ديگر تسهيل مي شود . سوال در مورد ارتباط پاتوژنسيته ويروسهاي H5N1 هنگ كنگي در موش باتوانايشان در بيماريزاي در انسان وديگر گونه هاي پستانداران منطقي مي باشد . ليكن انتخاب سريع واريانتهاي نوروتروپيك درموش ارتباط نزديكي با انتخاب سريع مشابه واريانتهاي بيماريزا براي پستانداران دارد . تصميم كشتار طيور در هنگ كنگ در سال 2001 يك راه مفيد براي ريشه كني اين ويروسها وجلوگيري از انتخاب چنين واريانتهاي بسيار پاتوژني بود .

Accession تواليهاي نوكلئوتيدي

تواليهاي نوكلئوتيدي بدست آمده دراين مطالعه در ژن بانك تحت شماره از Accession
AY221592 تا AY221521 نگهداري مي شود .
ارزيابي ويروسهاي آنفولانزاي H5N1 در اردكهاي جنوب چين

خلاصه :

پاتوژنسيته ويروسهاي آنفولانزا در پستاندران از اواسط دهه 1980 مورد ارزيابي قرار گرفت . دراينجا ، نشان مي دهيم كه ويروسهاي آنفولانزاي H5N1 ، كه از اردكهاي به ظاهر سالم mainland چين از سال 1999 ، تا 2002 جدا شده اند ، بطور تصادفي پاتوژنسيته آنها براي پستانداران بالا رفته است ، وبطور فرضي مكانيسم اين ارزيابي مستقيم را شرح مي دهيم . 21 ويروس از اردكهاي بظاهر سالم در جنوب چين از سال 1999تا 2002 جدا شدند كه تاييد شد اينها تحت تيپهاي ويروس آنفولانزاي A , H5N1 مي باشند .اين ويروسهاي جدا شده از نظر آنتي ژنتيكي به ويروس H5N1 A/GOOSE/Gvangdong/1/96 مشابه مي باشند كه منبع ژن هماگلوتينين آنفولانزاي پرندگان در هنگ كنگ در سال 1997 بود و تمامي آنها در جوجه ها بسيار بيماريزا بودند .
ويروسها به 4 پاتوتيپ بر اساس همانند سازي و قدرت كشندگي براي موش تقسيم بندي شدند . يك الگوي واضح در افزايش تصاعدي بيماريزاي اين ويروسهاي جدا شده در مدل پستانداري وجوددارد . 5 تا از 6 H5N1 جدا شده در مرغابي هايي كه مورد تلقيح قرار گرفتند همانند سازي كردند وآنها از مجراي كلوآكه وتراكه ريزش ويروسي داشتند ولي هيچ كدام علائم بيماري را نشان نداند واز بين نرفتند . بررسي فيلوژنيك ژنوم كامل دلالت بر اين امر دارد كه بيشتر ويروسهاي نوترتيب حاوي ژن شبيه A/GOOSE/Guangdong/1/96 هماگلوتينين هستند و ديگر ژنها از ويروسهاي ناشناخته روسي مي باشد . اين مطالعه بر روي تعين خصوصيات ويروسهاي آنفولانزاي H5N1 كه اخيراً‌ در ميان اردكهاي mainland چين در چرخش است متمركز مي باشد . يافته هاي ما پيشنهاد مي كند كه يك تلاش سريع و بلادرنگ براي جلوگيري از انتقال ويروسهاي آنفولانزاي مرغي بسيار پاتوژن از اردكهاي به ظاهر سالم به جوجه ها يا ميزبانهاي پستانداري ضروري مي باشد .

مواد وروشها
جدا سازي ويروس وشناسايي آن :

بعد از شناسايي ويروس A/Goose/Guang/1/96 (GSGD/1/96) (H5N1) بعنوان يك پيش ساز مهم ويروس آنفولانزاي هنگ كنگي سال 1997 (HK/97) مراقبتهاي روتين براي آنفولانزاي مرغي توسط مسئولين در شهرهاي Castol چين و استان هاي Guangdong , Guanxi,Fujian , Zhejiang , Shanghai شروع شد .
نمونه هاي كلوآك از اردكهاي به ظاهر سالم مزارع گرفته شدند . ويروسها در جنين تخم مرغ همانطوري كه در رفرنس توضيح داده شده جداسازي شدند . تمام 21 ويروس H5N1 بوسيله تست هاي جلوگيري از هماگلوتيناسيون ( HI ) ونورآمينيداز « NI» با يك جدول آنتي سرمي كه بوسيله دفتر بين المللي آزمايشگاه رفرنس به نام Des Epizooties محدود در چنين اختصاصي _ بيماريزا وتخم مرغ آزاد بطور بيولوژيكي كلون گرديد . تمامي آزمايشات با ويروسهاي H5N1 جدا شده در يك سطح biosafety با امكانات 3 آزمايشگاه انجام گرفت وآزمايشات بر روي حيوانات در isolator هاي با هواي فيلتر شده وضريب كارآيي بالا ( HEPA – filtered ) انجام گرفت .
آزمايش حيوانات ، جوجه ها :براي تعيين پاتوژنسيته ويروسهاي جدا شده شاخص بيماريزائي V 10 ( IVPI ) تست شد با توجه به دستور كار دفتر بين المللي DesEpizooties .
گروههاي 10 تايي جوجه هاي سفيد Leghorn ، 6 هفته واختصاصي و عاري از عوامل پاتوژن در قفس هاي جدا كننده نگهداري شدند وبا 2/0 ml از يك رقت 10/1 مايع آلانتوئيك عاري از باكتري وحاوي ويروس بصورت 10v مورد تلقيح قرار گرفتند .
10 جوجه اضافي بطريقه داخل بيني ( x10 ) با 6 10( eID50 ) egg 50% infeetive dose از هر ويروس در يك طيف 1/0 ml مورد تلقيح قرار گرفتند ، در روز سوم ، 3 تا از جوجه هاي هر گروه تلف شدند وميزان ويروس در نمونه هاي شش ، bursa ، كليه ، تيموس ، غده تيروئيد ، مغز ، قلب ، پانکراس ، ماهيچه معده ، طحال وتراكه تعيين تيتر گرديد . تست هاي مشابه بر روي پرندگاني كه تلف شده بودند انجام شد . اين بافتها همچنين از نظر هيستوپاتولوژيكي مورد مطالعه قرا گرفتند ، آنهادر بافر خنثي محلول سيلين 10% فيكس شدند وبا هماتوكسيلين وائوزين رنگ شدند . نمونه هاي فيكس نشده براي عفونت زائي ويروس درجنين هاي تخم مرغ تيتر شدند .
موش :گروههاي 8 تايي موش هاي ماده BALB 6 تا 8 هفته كمي با CO2 بيهوش شدند وبصورت n 10 با 0.610 ( CID50) از ويروسهاي آنفولانزاي H5N1 در يك طيف 50 ml مورد تلقيح قرار گرفتند.
موش كنترل با PBS تلقيح شد . در روز 3 ، سه تا از 8 موش را براي تيتر كردن ميزان ويروس در شش ها ، كليه ها ، طحال ، ومغز كشته شدن . دوز حداقل كه 50% موشها را مي كشد ( MLD50 ) بوسيله متد Muench , Reed محاسبه شد .
اردكها :گروههاي 5 تايي از اردكهاي 3 هفته بطريقه x10 با 85.7 10 تا 5.8 10 ( eIO50 ) از ويروس آنفولانزا در 1/0 ml مورد تلقيح شدند . اردكها روزانه براي 10 روز از نظر بروز علائم بيماري تحت نظر گرفته شدند . نمونه هاي سوآپ كلوآك و oropharyngeal ازتمامي اردكها ، 3 و 5 روز بعد از تلقيح براي تيتراسيون ويروس در تخمها جمع آوري شدند .
بررسي ژنتيكي وفيلوژنيكي : RNA ويروسي از مايعات آلانتوئيك بوسيله استفاده كيت RNeasy , Mini خالص سازي شدند و نسخه برداري معكوس شدند . تكثير با PCR بوسيله استفاده از پرايمرهاي اختصاصي قطعات انجام گرفت . محصولات PCR با Kit خالص سازي QIA-quick PCR خالص سازي شدند و با استفاده از كيت Quick start – CEQDTCS بر روي يك DNA سكوانسر CEQ8000 تعيين توالي شدند . اطلاعات مربوط به توالي هابا برنامه SEQMAN نوشته شدند وتوالي هاي نوكلئوتيدي مقايسه شدند ودرخت فيلوژنيك با برنامه MEGALIGN با استفاده از الگوريتم مسير GLSTAL ساخته شد .
شماره Accession توالي هاي نوكلئوتيدي : توالي هاي نوكلئوتيدي كه در اين مطالعه به دست آمدند از ژن بانك با شماره :
( accession nos . AY585357 – AY85524 ) قابل دسترسي هستند .

نتايج :

بررسي آنتي ژنيكي : تستهاي HI , NI با آنتي سرمهاي رفرنس نشان داد كه هر يك از ويروسها تحت تيپهاي H%N! مي باشند . ويروسها داراي الگوي مشابه واكنش HI < NI هيچ گونه شواهدي دال بر دريفت آنتي ژنتيكي در ويروسهاي جدا شده از 1999 تا 2002 وجود ندارد بعنوان مثال تيترهاي هترولوگوس HI كمتر از 4 بود – تا خوردگي كمتر از تيترهاي هترولوگوس HI بود .
مطالعات در جوجه ها : ما از IVPI وروش پيشنهادي دفتر بين المللي Des Epizooties براي ارزيابي بيماريزايي ويروس درجوجه ها استفاده كرديم .
تمام جداشده ها ، با اين معيار بيماريزا بودند « جدول 1 » . ليكن يكي از آنها زودتر جدا شدند ( OKGX/07/99 ) فقط نيمي از جوجه هايي را كه به صورت V10تلقيح شده بودند كشتند. وميانگين زمان مرگ (MDT) دو تا از جدا شده هاي اوليه 8 روز بعد ازر تلقيح به صورت x 10 بود . ويروسهاي H5N1 جدا شد در سال 2000 تنوع در MDT
(807 تا 303 ) بعد از تلقيح به صورت x 10 نشان دادند ، در حالي كه نمونه هاي جداشده در سالهاي 2002 و2001 داراي MDT بين 7/1 و4 بعد از تلقيح x 10 بودند ( تنها استثناد DKGX/53/02 بود كه يك MDT بيش تر از 5/6 بود ) .يك تمايل به زياد شدن افزايش در IVPA در وقت اضافي وجود دارد . در 7 تااز نمونه هاي جدا شده در 1999 و 2000 IVPA 3-9/2 بود. استثناء DKGX/53/02 بود كه IVPA آن 1/2 و MDT بيش تر از 5/6 روز داشت كه دال بر پاتوژنسيته خيلي كمتر مي باشد ، تمام جوجه هايي كه در روز 2و3 بعد از تلقيح مردند داراي جراحاتي بودند كه دلالت بر همانند سازي سيستميك ويروس مي كرد . آنها داراي نكروز متوسط بافت مغز ، پنوموني شديد هيستوسايتيك همراه با ادم ، نكروز حادپانكراس ، نكروز خفيف طحال ، نفروزيس حاد يا ضعيف و نكروز خفيف تا حاد بورسابودند . فقط شواهد مربوط به DKGX/07/99 دال بر تكثير غير سيستميك داشت .

مطالعات در موش :

بيشتر ويروسهاي شديداً پاتوژن آنفولانزاي مرغي روسي جدا شده از سال 1997 قادر به تكثير در پستانداران بودند . قبل از تست كردن بيماريزايي آنها در موش ، ما بطور بيولوژيكي هر ويروس جداشده را بوسيله 3 چرخه محدود رقت در جنين هاي جوجه اختصاصي – بيماريزا وبدون جنين كلون كرديم .
هيچ پاساژ كوري در موش انجام نشد . اطلاعات ما از يك پاساژ x 10 در موش به دست آمده اند .
بر اساس توانايي تكثير وقدرت كم كردن وزن و ايجاد مرگ ومير « جدول 2وشكل 1 » ، ويروسهاي H5N1 جدا شده به چهار گروه تقسيم شدند . هنگامي كه ويروس از هيچ ارگان موش 3 روز بعد از تلقيح با 6 10eID50 جدا نشد وهيچ كاهش وزني ومرگ وميري درموش مشاهده نشد ويروس در موش غير پاتوژن محسوب مي شود . ويروسهايي كه مي توانستند درموش تكثير كنند بيشتر به گروههاي پاتوژنسيته كم (LD506.5Log 10 eID50 M ) ، متوسط ( 3log10eID50 MLD50 6.5log10eID50 ) يا زياد ( MLD 3log10eID50) ، بر اساس قدرت كشندگيشان در موش تقسيم بندي مي شدند . گروههاي غير پاتوژن داراي 7 ويروس ( شامل GSGD/1/96) بودند كه در موش تكثير نمي كردند وباعث كاهش وزن نيز نمي شدند ، فقط يك ويروس ( DKGX/22/01 ) موجب تغييرات سرمي مي شدند . گروه كم پاتوژن حاوي 4 ويروس بود كه با تيتر نسبتاً پاييني در ششها تكثير مي كردند، تمام اين موشها تا روز 14 بعد از تلقيح دچار تغييرات سرمي شده بودند .
يك دوز بالا از اين ويروسها ( eID50 بيشتر از 5.6 10 ) براي كشتن موش مورد نياز بود تمام 7 ويروس درگروه با بيماريزائي متوسط در ششهاي موش تكثير پيدا كردند . سطح پاييني از دو ويروس درطحال تشخيص داده شد ويكي از ويروسهاي جدا شده (DKSH/8/01 ) در سطح خيلي پائيني در مغز يافت شد . تمامي اين ويروسها سبب عفونت كشنده درموش شدند اما دوز بالاي ويروس ( eID50 6 10 تا 4 10 ) و طيف MLD50( از 407 تا ( 604log10eID50 مورد نياز بود .
4 ويروس بسيار پاتوژن با تيتر بالائي در ششهاي موش تكثير مي يابند و وجود ويروس در طحال ، كليه ومغز دال بر عفونت سيستميك مي باشد . MLD50 ويروسها در اين گروه كمتر از (203log10eID50 ) بود .
ما يك افزايش سطح پاتوژنسيته براي موش را با پيشرفت زمان مشاهده كرديم :
ويروسهاي جدا شده در سال 1999 و 2000 براي موش كمتر بيماريزا بودند نسبت به آنهايي كه در سال 2000 و2002 جدا شدند ، اگر چه يكي از ويروسهاي جدا شده در سال 2000 ( DKGD/40/00 ) در گروه با بيماريزائي متوسط قرار داشت ويكي از ويروسهاي جدا شده درسال 2002 ( DKGX/53/02 ) داراي بيماريزايي كم بود

مطالعات در اردكها :

اردكهاي وحشي ميزبان طبيعي ويروسهاي آنفولانزا هستند . تمام تحت تيپهاي آنفولانزاي مرغي از اردكهاي وحشي جدا شده اند وهيچ يك از آنها كه شامل تحت تيپهاي بسيار پاتوژن H5,H7 نيز مي باشند وهيچ سابقه تاريخي دال بر ايجاد بروز علائم يا مرگ در اردكها ندارند .
بطور غيرمنتظره ، ويروسهاي H5N1 جدا شده از مرغابي هاي وحشي در هنگ كنگ در نوامبر 2002 سبب بيماري شديد عصبي شد واردكها را هم درمزرعه وهم در آزمايشگاه كشت . ما گروههاي 5 تايي اردكها را با 6 ويروس H5N1 كه نماينده ويروسهاي مطالعه شده در اين تحقيق مي باشند شامل 3 ويروس از زير گروه بسيار پاتوژن درموش تلقيح كرديم . « جدول 3 ». 5 تا از 6 ويروس H5N1 جدا شده در مرغابي هاهمانند سازي كردند . آنها داراي ريزش ويروسي از تراكه يا كلوآك در سطح 2.0-403log10eID50/ml بودند . ويروسها در اثر تماس پرندگان در ايزولاتور منتقل نشدند وهيچ يك از ويروسها سبب بروز علائم بيماري يا مرگ در اردكها نشد . .
بررسي ملكولي وفيلوژنتيكي : براي تعين اساس ملكولي مشاهداتمان ، تمامي ژنوم هريك از 21 ويروس جدا شده تعيين توالي شدند. توالي ها با توالي هاي نماينده H5N1 شامل آنهايي كه از GSGD/1/96 وانواع انساني جدا شده از هنگ كنگ در سال 1997 HK/156/97 , HK/483/97 , HK/486/97 به دست آمده از بانك ژني مقايسه شدند .توالي هاي هماگلوتينين HA ونورآميند از NA مربوط به ويروس A/duck/Anyang/av – 1/01(H5N1) ( DK/AY/01 ) جدا شده از گوشت اردكهاي صادراتي از چين به جنوب كره نيز مورد بررسي فيلوژنيكي قرار گرفتند . .
ژنهاي NA ويروسهاي H5N1 جدا شده از ويروسها بيشتر به ژنهاي (GSGD/1/96 96.4-9803% همولوژي ) نزديك بودند تا ويروسهاي جدا شده HK/97 ازيك شاخه جداگانه با NA هايي مي باشد كه ما از اردكها جدا كرديم . NA هاي ويروسهاي جدا شده از اردكها به دو چنگال تقسيم مي شدند كه DKGX/07/99 پايه وستون چنگال GSGD/1/96 , B1 پايه چنگال B2 مي باشد . هر يك از اين چنگالها حاوي ويروسهاي جدا شده از 2000 تا 2002 مي باشد. DK/AY/01 در چنگال از GSGD/1/96 مشتق مي شود . بررسي توالي هاي آمينواسيدي بدست آمده نشان مي دهد كه تمامي ويروسهاي درچنگال كه از GSGD/1/96 مشتق مي شوند داراي يك حذف 20 آمينواسيدي در ساقه NA هستند ( بنيان 49 تا 68 ) ، در حالي كه خود GSGD/1/96 اين طور نيست . اين حذف درساقه NA ، داراي فاصله اما هم پوشاني با حذف 19 آمينواسيدي يافت شد در ويروسهاي HK/97 جدا شده از انسانها مي باشد . ( بنيان هاي 54-72 ) . هيچ حذفي در ويروسهاي NA در چنگال مشتق شده از DKGX/07/00 وجود ندارد.
درخت فيلوژي ژنهاي PA,PB1,PB2 از 22 ويروس H5N1 خيلي شبيه بودند .
« شكل 2 ،‌c_e » . ويروسهاي انساني HK/97 جدا شده از يك شاخه مجزا بودند ، در حالي كه ويروسهاي جدا شده از اردكها و GSGD/1/96 به دو چنگال اصلي كه در آن ويروسهايي كه جلوتر جداشده اند بطور غالب در يك شاخه هستند تقسيم بندي مي شوند . در درخت فيلوژني PB2 ، ژنهاي دوچنگال در شاخه B سهم زيادي از همولوژي راداشتند ومتعلق به يك دودمان مي باشند.
به بيان ديگر، چنگالهاي B1,B2 ژنهاي PB1.PA داراي 93-90% همولوژي بودند ومي توان آنها را به عنوان دودمان متفاوتي در نظر گرفت .
درخت فيلوژنيك «NP » نوكلئوپروتئين  متفاوت بود : ژنهاي NP از 3 ويروس جدا شده از اردكها ( DKSH/35/02 , DKSH/38/01 , DKGX/50/01 ) يك شاخه جدا گانه را تشكيل مي دهند ، درحالي كه HK/97 t NP انساني يك چنگال را تشكيل مي دهد وديگر H5N1 هاي جدا شده چنگالهاي چندتايي خواهر را كه با زمان يا محل جغرافيشان مطابقت نمي كند تشكيل مي دهند . درخت فيلوژنيك M« ماتريكس » ژن دقيقاً مشابه با درخت ژنهاي پلي مراز بود ، اما M ژنهاي DKGD/40/00 , DKFJ/19/00 درچنگال متفاوتي در شاخه B كه خودش به باقي مانده ها ، شامل ويروسهاي انساني HK/97در آلل B مجزا مي شدند  .
4 ويروس اردكي و GSGD/1/96 در آلل A قرار داشتند ، در حالي كه باقي مانده ها ، شامل ويروسهاي انساني hk/97كه خودش به دو شاخه تقسيم مي شد قرار مي گرفتند . در آلل B كه خودش به دو شاخه تقسيم مي شد قرار مي گرفتند . توالي هاي آمينواسيدي بدست آمده از تمام ويروسها درچنگال B1 از شاخه B درالل B داراي يك حذف 15-nt مي باشد كه منجر به يك حذف 5 آمينو اسيدي در NS پروتئين مي شود . «موقعيت 80 تا 84 » بر اساس تنوع ژنوميكي ، ويروسها 9 ژنوتيپ را تشكيل مي دهند كه تكامل و ارتباطات درشكل 3 نشان داده شده است .
اين مسئله كه ژنهاي مشابه PB2,HA,NA در ژنوتيپ هاي متفاوت يافت مي شوند قابل ملاحظه مي باشد. اتصال وارتباط قوي بين ژنوتيپ ويافنوتيپ اين ويروسها درموش وجود ندارد ، درحالي كه مسيرواضح از افزايش تصاعدي بيماريزايي اين ويروسها در ميان ژنوتيپهاي مشابه ، بخصوص ويروسهاي ژنوتيپ A,D ديده مي شود .
DHSH/35/02 ,DKSH/38/01 در ژنوتيپ مشابه قرار دارند . « F » ، اما DKSH/35/02 3 10 بار كشنده تر از DKSH/38/01 در موش مي باشد . بيماريزايي متفاوت دو ويروس در ژنوتيپهاي گروهي H,I بيشتر از به ترتيب 105X ,106 X مي باشد . اين نتايج پيشنهاد مي كند كه موتاسيونهاي بخصوص بيشتر از ساختار ژنومي ممكن است قدرت بيماريزايي آنها را تعيين سازد .

بحث :

اين مطالعه شرح مي دهد كه قبلاً جدا سازي ويروسهاي آنفولانزاي H5N1 تعيين خصوصيت نشده از اردكهاي منطقه mainland چين از GSGD/1/96(H5N1) گزارش شده اند.يافته هاي ما نشان مي دهند كه ويروسهاي آنفولانزاي بسيار بيماريزا از اردكهاي به ظاهر سالم در استان Coastal چين ( بين Shanghai , Guandong ) از سال 1999 تا 2002 جدا شدند . اين ويروس H5N1 جدا شده واكنش آنتي سرمي مشابه داشتند وژنهاي HA آنها از نظر فيلوژنيكي هموژنوس بود . تمامي آنها به جز يكي سبب عفونت كشنده و وسيع سيستماتيك در جوجه ها مي شدند و همگي داراي يك رديف هايي از آمينواسيدهاي پايه در محل برش HA بودند كه با بيماريزائي بالا همراه بود.
يافته هاي ما مشخص كرد كه ويروسهاي آنفولانزاي H5N1 درميان اردكهاي اهلي در چين از 1999 تا 2002 كه درچرخش هستند قادر به تكثير در موش بوده و سبب عفونت سيستماتيك ومرگ بدون سازگار شدن در موش مي شوند .
تعدادي از محققين گزارش كرده اند كه ويروسهاي H5N1 جدا شده از انسان براي موش كشنده هستند .
فاكتورهايي زيادي گزارش شده اند كه با بيماريزائي H5N1 همراه مي باشند. مطالعات معكوس ژنتيكي نشان داده كه بنيان 627 پروتئين PB2 يك نقش حياتي در بيماريزائي H5N1 در موش دارد ، همانطور كه داشتن رديفهايي از آمينو اسيدهاي اساسي در محل برش HA همين نقش را دارد . مطالعات ديگر نقش ژن NSوتوانائيش درتعديل پاسخ سيتوكايني را بازگو مي كند. مطالعات معكوس ژنتيكي نشان داده اند كه بان 92 از ملكول NS1 از نمونه هاي ويروسهاي (H5N1) A/HK/156/97 انساني با القاء بيماريزائي شديد در خوكها همراه مي باشد. ليكن ، تمامي ويروسهاي H5N1 اردكي داراي بنيان هاي آمينو اسيدي حفاظت شده GLV-627 در PB2,ASP-92,GLY-228 ( اعضاي H3) در محل باند شدن بارسپتور مي باشند . بنابراين ، اين بنيانها ممكن است كه در همانند سازي هاي متفاوت وبيماريزائي ويروسهاي H5N1 اردكي در موش شركت نكنند . سوال مهمي كه باقي مي ماند اين است كه چگونه و چه وقت ويروسهاي H5N1 توانايي تكثير پستانداران را پيدا كردند .
نتايج ما نشان مي دهد كه همانطور كه ويروسهاي H5N1 در ميان اردكهاي اهلي در چرخش هستند ، خصوصياتي درانها پديد مي آيد كه مي توانند براي موش كشنده باشند. يك شرح احتمالي براي اين يافته ها انتقال ويروسهاي H5N1 از اردك به انسانها ، تكامل انتخابي ويروسها در انسان ها ومتعاقباً انتقال دوباره آنها به اردك مي باشد . شواهد محدود سرولوژيكي از عفونت زايي H5N1 انساني وجود دارد همچنين شواهد محدودي نيز درباره انتقال فرد به فرد ويروسهاي H5N1 وجود دارد . شواهد در دسترس پيشنهاد مي كند كه از سال 1997 ، ويروسهاي آنفولانزاي آسيايي باعث عفونتهاي محدود كشنده يا حاد در انسانها مي شوند ، اما از انسان به انسان منتقل نمي شوند . انتقال بازگشتي ويروسها را از انسانها به اردكها را به سختي مي توان اثبات كرد ، علي رغم وجود شواهدي كه در مورد انتقال ويروسهاي آنفولانزاي مرغي H9N2 از اردكها به ديگر طيور و سپس برگشت آنها به اردكها وجود دارد.
مسئله اساس ملكولي ويروسهاي قابل انتقال به پستانداران حل نشده است . بطورعمده ژنهاي چندتايي ويروسي ، شامل HA دخيل هستند . تعدادي ساختارهاي ژنهاي مرغي چنين فرض مي شود كه باعث انتقال به پستانداران مي شوند. ويروسهاي آنفولانزاي H3N2كه درخوكها در سال 1997 در ايالت متحده وجود داشته اند نوترتيبهاي 3 تايي بودند كه حاوي قطعات ژني از ويروسهاي آنفولانزاي مرغي ، انساني وخوكي بودند. اين ويروسهاي نوترتيب 3تايي H3N2 درميان خوكها به ميزان بسيار بالايي منتقل مي شوند و در ايالت متحده انتشار وسيعي پيدا كردند .
به طور مشابه ، ويروسهاي آنفولانزاي خوكي H1N1 كه بطور رايج در اروپا داراي انتشار وسيع هستند حاوي ژنهاي ويروسهاي آنفولانزاي مرغي كه در سال 1999 يافت شدند مي باشند . در نتيجه ، ژنهاي ويروس آنفولانزاي مرغي ، وقتي كه آنها قسمت عمده اي از ساختار ژني باشند ، به نظر مي رسد كه بتوانند در ميان گونه هاي پستانداران منتقل شوند . ارزيابي ژنوتيپهاي مختلف ويروسهاي H5N1 در اردكها ممكن است ساختار ژنهايي را كه سبب انتقال به پستانداران مي شوند روشن سازد . احتمالات متفاوتي در مورد انتخاب خوك بعنوان ميزبان وجود دارد .« وجود يك ميزبان واسط » . در ناحيه اي از چين كه ويروسهاي H5N1 آنها در اين مطالعه تعيين خصوصيت شدند ، خوكها واردكها در كنار يكديگر نگهداري مي شوند خصوصاً در مزارع روستايي كه خانواده ها داراي تعداد كمي خوك واردك هستند . فرضيه كار ما اين است كه ويروسهاي H5N1 بتدريج توانايي تكثير در پستانداران را از طريق انتخابي كه تحت فشار رخ مي دهد وهمچنين احتمال انتقال بين خوكها واردكها پيدا مي كنند . امروزه ، هيچ گزارشي از جداسازي ويروسهاي H5N1 از خوكها وجود ندارد ، اگر چه خوكها بطور آزمايشگاهي باويروسهاي H5N1 عفوني شده اند . ما اخيراً شواهد ويروس شناسي وسرولوژيكي از عفونت زائي ويروس H5N1 در خوكها دراستان Fvjian بدست آورديم .

مقدمه :

ويروس آنفولانزاي مرغي FPV Rostock بر روي سلولهاي L موش پلاك تشكيل نمي دهد .طيف ميزباني ويروس موتانت FPV Doboson يك ويروس كه بطور نزديكي FPV Doboson مرتبط مي باشد بوسيله پاساژهاي مكرر در انواع سلولهاي پستانداران شامل سلولهاي L ,Hela ,BHK انتخاب شد . اين ويروس ، كه بعنوان Dobson 4H شناخته شده ، پلاك هاي شفاف در سلولهاي L تشكيل مي دهد . كارهاي قبلي با ويروسهاي نوترتيب نشان مي دهد كه فنوتيپ تشكيل دهنده پلاك بوسيله قطعه 1RNA كه تحت واحد PB2 از كمپلكس پلي مرازي ويروسي راكد مي كند پديد مي آيد . ما در حال تلاش براي فهم اساس ملكلولي اين محدود شدن طيف ميزبان هستيم چرا كه ممكن است سر نخ هاي مهمي را در مورد وقايعي كه انتقال ژنوتيك ويروسهاي آنفولانزاي مرغي را به مزبانهاي پستانداري افزايش مي دهد به ما دهد

بحث :

دليل اينكه چرا تغييرات در پروتئين PB2 ممكن است سبب از دست دادن توانايي تشكيل پلاك بر روي رده سلولي پستانداران مي شود هنوز روشن نشده است . PB2 يك بخش محلق شونده به كمپلكس پلي مرازي است . SHIH ,Krug پيشنهاد كردند كه باند شدن پلي مراز ويروسي با پروموتورتاخيري درعفونت ممكن است چنگال همانند سازي را تنظيم كند وهمچنين نشان داده اند كه چنگال همانند سازي بستگي به پروتئين هاي سلول ميزبان دارد .
اين مسئله كه تغيير در توالي هاي PB2 اثر مي گذارد بر روي تمايل كمپلكس پلي مرازي براي اينكه RNA بتواند نقص در تنظيم چنگال را در سلولهايي كه فاقد يا دچار كمبود درفاكتورهاي عمده سلول ميزبان هستند جبران كندقابل درك مي باشد.
همبستگي آنتي ژنتيك بين نورآمينيداز A/H5N1 وآنفولانزاي پاندميك 1918 پاندميك هاي A/H5N1 ما را بر آن داشت كه وضعيت سرولوژيكي جمعيت هاي فرانسوي را در مقابل سويه A/HK/156/97 بررسي كنيم .

بحث :

مشاهدات هنگامي انجام گرفت كه 198 سرم فاقد آنتي بادي هاي anti-A/HK/145/97 HI در تست NIدر مقابل ويروس A/HK گزارش شد وسپس هنگام بررسي به عنوان يك فعاليت بر روي گروههاي سني ، ما ابتدا اساس كارمان را بر روي افرادي كه داراي ملاقات با سويه هاي پاندميك 1918 ويا 1934 بودند گذارديم . درواقع ، يك طيف غير منتظره بالا از شيوع آنتي بادي هاي anti-A/HK NI در سرمهاي افرادي با دو محدوده سني 75-95 و 98-76 مشاهده شد در حالي كه يك شيوع خيلي پائيني در اشخاص زير 59 سال ديده شد . شباهت نزدكي بين شيوع سني پروفيل آنتي بادي هاي anti-A/HK NI و anti-A/HK نزديكي ارتباط آنتي ژنيك را بين NA اين دو ويروس پيشنهاد مي كند .
سرمهاي متعدد انساني مشاهده شده كه قادر به خنثي سازي عفونت زائي ويروس A/HK در محيط آزمايش هستند ، بطور عمده سرمهايي كه متعلق به افراد با گروه سني 98-76 سال مي باشند . همچنين متعاقباً شيوع آنتي بادي NT بسيار مرتبط با شيوع آنتي بادي NI در اين گروه مي باشد ( anti A/HK , anti-A/PR8 ) برعكس آن چيزي كه درگروه سني 60 تا75 سال مشاهده شد .
از اين اطلاعات مي توان دلائل منطقي براي فرضيه هاي زير آورد :
در گروه سني 60 تا75 سال ، وجود قبلي آنتي بادي هاي NI احتمالا در اثر تماس مستقيم با ويروس A/PR8 مي باشد ، قادر بود كه فعاليت آنزيماتيك ويروس A/HK ممانعت به عمل آورد اما نمي تواند اثر خنثي كنندگي بر روي عفونت زائي ويروس داشته باشد .
در گروه سني 76 تا98 وجود قبلي آنتي بادي هاي NI احتمالا به دليل تماس مستقيم با سويه پاندميك 1918 قادر است از فعاليت آنزيماتيك هر دو سويه A/PR8 , A/HK جلوگيري مي كند وهمچنين مي تواند از اثر خنثي كننده بر روي ويروس A/HK داشته باشد .
دراين مطالعه ، حذف نقش احتمالي آنتي بادي هاي anti-HA ما را قادر مي سازد كه راه احتمالي نقش حفاظت كنندگي آنتي بادي هاي ضد NA را بوسيله نشان دادن قدرت خنثي سازي بعدي ها پيدا كنيم .
اطلاعات ما دلايل سرولوژيكي براي نزدكي ارتباط بين NA از A/HK وسويه H1N1 كه در پاندمي 1918 جدا شد مي آورد . چنين همبستگي آنتي ژنيكي بين اين دو نورآميينداز با اطلاعاتي كه مادرباره توالي هاي نوكلئوتيدي آنها داريم سازگار مي باشد . بعلاوه ، yuen وهمكارانش در سال 1998 و Glass وهمكارانش در سال 1998 پيشنهاد كردند كه ويروس H1N1 مسئول پاندميك انساني مه 1918 باعث داخث شدن مستقيم ويروس آنفولانزا به جمعيت انسان بوده است .

قسمت دوم : پاتوژنزيس ، ويرولانس و ايمني

تغييرات ساختماني هماگلوتينين ويروس آنفولانزا كه بيماريزايي راتحت تاثير قرار مي دهد .
هماگلوتين ويروس انفولانزاي مرغي (AI) به نظر مي رسد كه داراي اين خصوصيت منحصر به فرد است كه آمينواسيدهاي بازيك رادر جايگاه برش پرتئولتيك خود قبول مي كند (PCS ) . همراه بودن امينواسيدهاي چندتايي بازيك با انتشار بافتي و بيماريزائي توسط سويه هاي AI اولين بار توسط Klen K, Rott, orlich وديگران در اواخر 1970 پيشنهاد شد وبراي دو دهه همچنان حفظ شده است . در حالي كه ديگر خصوصيات ساختماني و ديگر ژنهاي نيز مي توانند بطور عمده بيماريزايي را تحت تاثير قرار دهند ، وجود آمينواسيدهاي چندتايي بازي در pcs يك ساختمان نشان دار را پديد مي آورد كه ادامه بررسي توالي هاي سويه هاي AIجدا شده از مزارع را توجيه مي كند .
بعلاوه ، با اين شماي ساختماني نوك HA را مستعد نمايان و پنهان كردن محل هاي گليكوز يلاسيون مي كند ، كه تعدادي از انها با بيماريزايي همراه هستند.
براي مثال، درآزمايشگاه ما نشان داده شده كه وجود كربوهيدراتها نزديك به محل باند شدن بارسپتور ( RBS) يك ويروس جدا شده AI از نوع H7 با افزايش بيماريزائي در جوجه ها همراه بود .
ويروسهاي H5N1 كه در سال 1997 در هنگ كنگ ظاهر شدند از دو نظر منحصربه فرد بودند هم از نظر ساختمان پروتئين HA شان وهم از نظر پاتولوژي در حيوانات . اين ويروسهاي مرغي حاوي آمينواسيدهاي بازي چندتايي درمحل برش بودند ويك محل اضافه شدن كربوهيدرات قابل موتاسيون در قسمت نوك محل باند شدن بارسپتور . آنها بسيار در جوجه ها كشنده بودند اما برخلاف ديگر سويه هاي شديداً بيماريزايي AI آنها براي موش نيز كشنده بودند . پس اين ويروسها يك مدل ايده آل براي مطالعه شماي ساختماني HA ويروسهاي بسيار پاتوژن را فراهم مي آورند .
تعيين خصوصيات يك ( Alty/Eng/87-92/91) H5N1 جدا شده كه داراي آمينواسيدهاي باز يك چند تايي درمحل برس HA مي باشد .
دو ويروس H5N1 از فقط يك اردك طي شيوع آنفولانزاي مرغي شديد (HPAI) در Norfolk انگليس درسال 1991 جدا شد . يكي كه (A/ty/Eng/50-92/91 ) براي طيور اهلي خيلي بيماريزا بود داراي اسيدآمينه هاي چندتايي باز يك در محل برش HA بود و بخوبي درسلولهاي MDCK بدون اضافه كردن تريپسين رشد مي كرد كه از خصوصيات تيپيك ويروسهاي ( HPAI) مي باشد .
ديگري (A/ty/Eng/87-92/91 ) داراي محل برش مشابه بود اما بيماريزانبوده وبر روي سلولهاي MDCK حتي با اضافه كردن تريپسين رشد نمي كرد . دو ويروس جدا شده هيچ فرقي از نظر ژن HAكه با بيماريزائي آنها مرتبط است نداشتند . اين مطالعه بر روي رشد و خصوصيات ملكولي پاساژ يك رقت محدود كلون ( A/ty/Eng/87-92/91) مي باشد . 

بحث :

ويروس (A/ty/Eng/87-92/91) H5N1از مغز يك اردك كه دراثر HPAI مرده بود جدا شد . ليكن ، كلون LDP3 بدست آمده از اين ويروس قادر نبود كه در بدن منتشر شود يا درمغز جوجه هاواردك ها تكثير پيدا كند همانطور كه درمورد ويروسي با آمينو اسيدهاي باز يك چندتايي در محل برش انتظار مي رود . پاساژ در جنين 14 روزه تخم مرغابي براحتي موتاسيونهايي را از كلونهاي غير بيماريزاي LDP3 از A/ty/Eng/87-92 كه مي توانست در سلولهاي MDCK درغياب تريپسين رشد كند انتخاب كرد .
اين موضوع مخالف با پاساژ LDP3 در جوجه ها يا جنين 10 تا 11 روزه تخم مرغابي بود كه در توليد موتانت هايي كه بتوانند در MDCK رشد كنند . اين افزايش بيماريزائي ليكن ، به بيماريزائي در جوجه ها ترجمه نمي شود ، كلون G30 يك IVPI از تغييرات O.NO به نظر مي رسد در توالي هاي نوكلئوتيدي HA وابسته به ويروس والد LDP3 مي باشد و بنابراين فشار انتخابي ، باعث توانايي رشد موتانت هاي B22,G33 در سلولهاي MDCK شده بايستي در جاي ديگري از ژنوم قرار گيرد .
آزمايشات نوترتيبي منجر به اين حدس شد كه ژنهاي ماتريكس و PB2ممكن است كه درتعديل پاتوژنسيته نقش داشته باشند . بنابراين ژن كامل PB2 براي كلون هاي 2L G33,LDP3 توالي نوكلئوتيدي بودند كه بطور روشن 3 تغيير آمينو اسيدي از آن استنتاج شد كه به نظر مي رسيد با بيماريزايي مرتبط باشد . ليكن ، تعيين توالي نسبي كلونهاي 87V , 5L نشان داد كه ارتباطي بين تغييرات آمينو اسيدي استنتاج شده و IVPI وجود ندارد .
اخيراً ، پيشنهاد شده است كه گليكوزيلاسيون اضافي HA همراه با يك ساقه كوتاه NA خصوصيات ويروسهاي مرغي H7 , H5 مي باشد . جالب اينكه ژنهاي NA از A/ty/Eng/50-92/929 . LDP3 داراي يك حذف پيش بيني شده 23 آمينو اسيدي در مقايسه با A/parrot/NI/73 مي باشد . ليكن هيچ يك از اين ويروسهاي جدا شده داراي محلهاي گليكوليزاسيون اضافي بر روي HA نبودند پس يك استثناء را براي اين نقش پديد مي آورد .« 7 ، صفحه 15 »
روش ژنتيك معكوس نشان مي دهد كه رشد ويروس آنفولانزا بوسيله گليكوزيلاسيون هماگلوتينين تنظيم مي گردد .
عفونت ويروس آنفولانزا بوسيله باند شدن ذره ويروسي با رسپتورهاي اسيد سياليكي بر روي سطح سلول ميزبان آغاز مي شود . اين عمل باند شدن توسط گليكوپروتئين HA انجام مي شود . منطقه اي از HA كه با رسپتور باند مي شود نشان داده شده كه يك پاكتي از آمينو اسيدها در منطقه مسئول باند شدن دخيل مي باشند . در HA ويروس طاعون مرغابي ها ( A/FPV/Rostock/34 ) اين پاكت باند شونده در طرفين خودداراي دو زنجيره جانبي اليگو ساكاريد N-Linked مي باشد . در مطالعات قبلي كه درآن موتانتهاي FPV-HA فاقد هر يك « موتانت G1,G2» يا دو « موتانت G1,2 » محلهاي ژنهاي گليكوزيلاسيون بودند كه به كمك يك وكتور SV40 بيان شدما نشان داديم كه اين گليكان ها تمايل باند شدن رسپتور را تعديل مي كنند.
دراين مطالعه ما بر روي اين موضوع كه چگونه اين تخليه گليكاني بر روي رشد ويروس اثر مي گذارد وقتي كه HA موتاسيون يافته به طور پايدار از طريق يك روش ژنتيك معكوس به ويروسهاي نوتركيب اضافه شود كار كرديم .
در اين سيستم يك قطعه HA موتاسيون يافته شبه ويروس آنفولانزا در هسته سلولهاي عفوني شده بوسيله RNA پلي مراز I سلولي از يك حامل پلاسميدي نسخه برداري شد . بر اساس عفونت سلولها با يك ويروس كمكي مناسب قطعات موتاسيون يافته HA با ويريونهاي پروژني تركيب مي شوند .
دو ويروس نوترتيب A/WSN/33 بعنوان ويروسهاي كمكي براي بوجود آوردن دو سري از ويروسهاي نوتركيب موتانت HA مورد استفاده قرار گرفتند كه فقط در NA كه حمل مي كنند فرق مي كنند به ترتيب تحت تيپ هاي N1 يا N2 .
دراينجا ما نشان داديم كه فقدان يكي « موتانت G2» يا دوتا « موتانت G1,2 » گليكان داراي اثر شديدي بر روي رشد ويروسهاي حاوي N1-NA اثر دارد كه بطور عمده سبب آزادسازي يك ويروس پروژني ترميم نيافته از سلولهاي عفوني مي شود.
براي ويروسهاي N2-NA چنين محدوديت هاي رشدي باموتانت G2 قابل تشخيص نيست با موتانت G1,2 كمتر ظاهر مي شود . نتايج ما دلالت بر اين مي كند كه بر هم كنش بين محل باند شدن رسپتور واليگوساكاريدهاي مجاور HA براي توانايي رشد ويروسهاي آنفولانزا درسلولهاي ميزبان تعيين كننده مي باشد .

بحث :

بوسيله برداشت پشت سر م زنجيرهاي جانبي اليگوساكاريدي از نوك ملكول HA ما نشان داديم كه فعاليت باندشدن رسپتور بتدريج بوسيله اين گليكانها تنظيم مي گردد. بعلاوه ، اين تنظيم باند شدن رسپتور بسيار وابسته به طبيعت جفت شدن NA ويروس است .
از آْنجايي كه اخيراً شرح داده شده كه گليكوزيلاسيون HA وتحت تيپ NA يك نقش قطعي را در تعيين طيف ميزباني وسازگاري با ميزبانهاي جديد ويروسهاي آنفولانزا دارد ما مراحل دستكاري اختصاصي اين اعمال را به منظور ساخت يك ويروس يا خصوصيات رشد شناخته شده تعيين كرديم .
در نتيجه ، روش ژنتيك معكوس ما يك ابزار آزمايشگاهي عالي را براي مطالعه بر هم كشش وجفت شدن انواع مختلف HA,NA توليد ويروسهاي آنفولانزا با توانايي تنظيم دقيق فعاليت باند شدن با رسپتور فراهم كرده است . 
M1 پروتئين ويروس آنفولانزاي A با PACK1 « رسپتور Cكنياز فعال » انساني تداخل پيدا مي كند .
ويروسهاي آنفولانزا اعمال سلول ميزباني را دستكاري كرده ودر اختيار خود مي گيرند . ما علاقمند به شناسايي فاكتورهاي سلولي كه بوسيله برهم كنش پروتئين – پروئين هدف ويروس قرار مي گيرند هستيم .
ما قبلاً پروتئين هايي را كه با پروتئين NS1 ويروسي تداخل دارند شناسايي كرده ايم و اين مطالعات را بر روي پروتئين M1 ماتريكس از ويروس آنفولانزاي A توسعه داده ايم گزارش شده كه m1 پروتين هم نقش ساختماني وهم نقش تنظيمي در سر هم بندي شدن ونشدن ويروس و تنظيم نسخه برداري RNA وانتقال داخل سلولي قطعات RNP ژنوميك دارد . بعلاوه ، M1 پروتئين هاي تحت تيپهاي A,B,C روشن شده كه بر روي بنيان ترئونين وسرين در سلولهاي عفوني فسفريله شود . فسفريلاسيون قابل ملاحظه M1 پروتئين ومطابقت كينازها هنوز تعيين نشده است . ما فرض كرديم كه يكي يا بيشتر ازخصوصيات M1 پروتئين بوسيله تداخلها با فاكتورهاي ناشناخته سلولي تعيين مي گردد. به منظور شناسايي چنين تركيبات سلولي ، ما از سيستم مخمر دوهيبدريدي با پروتئين M بعنوان يك طعمه استفاده كرديم .
بعنوان يك نتيجه ، ما 4 كلون CDNA غير وابسته را جدا كرديم كه بطور اختصاصي با M1 پروتئين در سيستم دوهيبريدي مخمر تداخل داشت و با پروتئين بسيار حفاظت شده ( receptor of activated ) RACK1 بر هم كنش دارد .
RACK1 قبلاً پيشنهاد شده كه بعنوان يك پروتئين رسپتور داخل سلولي براي فعال شدن پروتئين كنياز C(PKC) عمل مي كند . ما بر روي نقش احتمالي تداخل بين M1-RACK1 براي فسفريلاسيون M1 پروتئين بحث كرديم . ( 7 ، صفحه 18)

بحث ونتايج :

ما از M1 پروتئين بعنوان يك طعمه در سيستم دوهيبريدي مخمر براي جستجوي يك كتابخانه CDNA بيان شونده براي فاكتورهاي تداخلي استفاده كرديم . 4 ، CDNA با پروتئين RACK1 انساني كه بطور اختصاصي با M1 پروتيين جدا شده باند مي شدند مطابقت مي كردند . بر هم كنش ژنتيكي بوسيله با هم رسوب دادن اختصاصي M1 پروتين از عصاره سلولهاي عفوني با ويروس با استفاده از يك فيوژن پروتئين GST-PACK1 در روش GST-Pull down تاييد شد.
PACK1 يك پروتئين 36 كيلو دالتوني بسيار حفاظت شده است كه حاوي 7 دمين WD40 داراي انواع مختلفي از پروتئين هاي تنظيمي هستند و واسطه تداخل پروتئين يا پروتئين هستد . PACK1 پيشنهاد شد ه كه بعنوان يك پروتئين رسپتور داخل سلولي كه به فرم فعال PCK در غشاء ها يا تركيبات اسكلت سلولي متصل مي گردد .
با توجه به تداخل M1-PACK1 ما سردرگم شديم اگر كه PCK بتواند فسفريلاسيون M1 پروتئين را وساطت كند . ما توانستيم نشان دهيم كه پروتئين نوتركيب M1 بوسيله PKC خالص در محيط آزمايشگاه فسفريله مي شود . M1 پروتئين بوسيله PKC فسفريله مي شود در طول عفونت ويروسي .
اين يافته ها ممكن است دلالت بر اين كند كه عمل تداخل M1-PACK1 طي فسفريلاسيون M1 پروتئين انجام مي گيرد . تغييرات ژنتيكي درحساسيت نسبت به Zanamivir در تكثير invitro كه بطور طبيعي در ويروسهاي آنفولانزاي مرغي رخ مي دهد .

آنالوگ سياليك اسيد به نام Zanamivir

( 4-guanidino -2,4 – dideoxy -2,3 – dehydro –N-acetyneuraminic acid )
يك ممانعت كننده باتمايل واختصاصيت بالا از باند شدن طبيعي NA از ويروسهاي آنفولانزاي A,B مي باشد. واريانت هاي مقاوم به Zanamivir ، كه داراي موتاسيون در NA ويا HA هستندبه وسيله پاساژهاي مكرر در حضور دارودر كشت بافت جدا شده اند . ما قبلا نشان داديم كه ويروسهاي آنفولانزاي معمول تغييراتي را در حساسيت همانند سازيشان نسبت به زاناميوير در كشت بافت نشان مي دهند .
ويروس A/DUCK/Ireland/113/83 H5N8 « ويروس اردكي ايرلندي » بسيار حساس مي باشد ، A/FPV/Egypt/45 H7N1 « Egyt» ، A/FPV/England/1/63 H7N3 ( Langham ) حساسيت متوسط و « يك ويروس نوترتيب كه داراي HA,NAاز A/FPV/Kostack /34(H7N1) SD17 نسبتا مقاوم مي باشد .
ليكن ، براي هر 4 ويروس ، فعاليت NA بوسيله زاناميويرممانعت مي شود ، در حالي كه فعاليت هماگلوتيناسيوني نسبتا به زاناميوير حساس مي باشد.
ويروسهاي نوترتيبي كه از اين 4 ويروس حاصله شده است ، به منظور شناسايي ژنهايي كه درتغيير حساسيت نسبت به زاناميوير در in vitro وبراي شناخت مكانيسمي كه اين ژنها بر روي حساسيت تاثير مي گذارند مورد مطالعه قرار گرفته است .
اين اطلاعات را مي توان براي پيش بيني خصوصيات ويروسهاي پاندميك هاي جديد آنفولانزا درانسانها كه ممكن است دراثر استفاده گسترده از داروي زاناميويز پديد آيند استفاده كرد

بحث :

حساسيت هاي متفاوتي كه نسبت به داروي زاناميوير در محيط كشت بافت وجوددارد را مي توان بر اساس خصوصيات NA,HA آنها شرح داد .
ما پيشنهاد مي كنيم كه باند سياليك اسيد با موقعيت 158 از SD17 ممكن است پاكت باند شونده رسپتور را پر كند ، وبا سياليك اسيد براي چسبيدن به رسپتورهاي سلولي ويا ذره ويروسي رقابت كند .
در نتيجه ، ويروسهايي كه داراي اين HA هستند مي توانند با جدا شدن ازرسپتورها با كاهش وابستگي به فعاليت NA ودر كشت بافت كمتر به زيناوير حساس باشند. NA با ساقه بلند در آزاد سازي ويروس از رسپتورها كار آمدتر است تاNA يي كه داراي ساقه كوتاه مي باشد ، همچنين NA هايي كه داراي ساقه بلند هستند مي توانند بطور كارآمد از رسپتورها درغياب زاناميوير آزاد شوند ليكن ، به دليل اينكه ساقه بلند NA نقش بيشتري را درآزاد سازي ويروس از سلولها نسبت به NA با ساقه كوتاه ايفا مي كند ويروسهاي با NA ساقه بلند نسبت به زاناميوير دركشت بافت حساس تر مي باشند . ( 7 ، صفحه 23)

سيتوكاين ها در پاتوژنزيس آنفولانزا :

خصوصيات يك آنفولانزاي بدون عوارض جانبي در انسان وحيوانات بوسيله شروع ناگهاني تب ، لرز ، در عضله وعلائم تنفسي مي باشد .سلول هدف براي ويروس سلولهاي اپي تليال در طول كل دستگاه تنفس مي باشد ، اما الگوي عفونت ودرگير شدن قسمت پاييني دستگاه تنفس به نظر مي رسد كه در حيوانات مختلف فرق مي كند . مطالعات هيستولوژيك قسمت بالايي دستگاه تنفس ويا ششها بطور تيپك نكروز سلولهاي اپي تليال و انفيلتراسيون نوتروفيلي رانشان مي دهد . علي رغم توضيحات زياد كلينكي وپاتولوژيك ، علت علائم بيماري و پاتولوژيكي هنوز كشف نشده باقي مانده .اما شواهد رو به رشدي دل بر اينكه توليد اوليه سيتوكاين درمحل عفونت نقش در ايجاد التهاب وعلائم دارد در دست مي باشد . از ميان اين سيتوكاين ها مي توان به اينترفرون ( IFN- ) ، فاكتور نكروز دهنده تومور ( TNF-) ، اينترلوكين 1 و اينترلوكين 6 وتعدادي كموكاين اشاره كرد .
اين مرور بر روي تعدادي از نشانه هايي كه سيتوكاين ها طي آنفولانزا در انسان وخوك :
سينتيك تعدادي از سيتوكاين ها طي عفونتهاي تجربي آنفولانزا درانسان وخوك مورد مطالعه قرار گرفته است . در انسان تهوع ، بيماري سيتسميك ودرگيري قسمت بالاي دستگاه تنفس غالب مي باشد . در طول دوره حداكثر بروز علائم IFN- , IL-6 , TNF- , IL-8 در ترشحات بيني يافت شده است .
IFN- و IL- ارتباط مستقيم با تيتر ويروس وشدت بيماري دارند. ديگر سيتوكاين ها مانند IL-1B,IL-2 ,TGF-B ديده نشده كه بطور قابل ملاحظه اي افزايش پيدا كنند .
با استفاده از خوكهاي gnotobiotic ، يك مدل تجربي براي ايجاد آنفولانزاي خوكي براي محققين آزمايشگاهي فراهم آمد . علائم تيپيك كلينيكي وپاتولوژي شامل تب ، عدم تعادل، افسردگي ، تنگي نفس شديد و يك برونكوپنومونياي نكروزيش
مي باشد . سطح بالاي IL-1 ,TNF- , IFN- در مايع برونشهاي آلوئولار يك روز بعد از عفونت ديده مي شود . وقتي كه غلظت سيتوكاين ، تيترهاي ويروس در شش وشمارش نوتروفيل در BAL مقايسه گرديد ، يك ارتباط مستقيم بين هر سه وجودداشت .
بعلاوه بالا و پايين رفتن توليد سيتوكاين دقيقا با علائم كلينيكي مرتبط است .

القاء سيتوكايني در سطح سلولي :

مكانيسمهاي القاء سيتوكاين بوسيله ويروس آنفولانزا هنوز كاملا روشن نشده است و هنوز جوابي براي سوالي همچون : آيا توليد سيتوكاين در سلولهاي عفوني صورت مي گيرد يا ديگر سلولها ؟
كداميك از پروتئنها يا ژنهاي ويروسي دخيل هستند ؟ آيا مكانيسمهاي القاء براي سيتوكاين هاي مختلف متفاوت مي باشد ؟
تعدادي مطالعات TNF- ,IFN_ in vitro داده هاي متضادي را نشان داده است . تعداد سيتوكاين قوياً وابسته به نوع سلول مي باشد واستفاده از انواع مختلف سلول ممكن است توجيه كننده اين مغايرتها در مطالعات in vitro باشد . تاكنون سلولهاي توليد كننده سيتوكاين در in vitro طي بيماري آنفولانزا تعيين مشخصات نشده اند.
بنابراين ، ما منشا سلولي TNF- , IFN- در شش خوكهاي عفوني شده را بررسي كرديم . 

شواهد بيشتر در مورد نقش سيتوكاين ها در آنفولانزا :

سيتوكاين ها بخشي از يك شبكه پيچيده هستند وتعيين نقش سيتوكاين هاي اختصاصي در in vitro مشكل مي باشد ، دراينجا هم مطالعات آزمايشگاهي با استفادهاز راههاي مختلف وانواع حيوانات نتايج متضادي را داد . اين مطالعات ميزان قابل توجه IL-1B,IL-1 , TNF- , IFN- در پاتوژنز آنفولانزا تاييد كرد. ليكن ، اثر بلوك كردن سيتوكاين هاي اختصاصي فقط تا حدودي بود ودر تعدادي موارد خيلي خفيف بود . مطالعات در موش صحرائي به عبارت ديگر در پيدا كردن شواهدي براي نقش IL-1 . IL-6 , TNF- در القاء تب در آنفولانزا به نتيجه نرسيد

بررسي فاكتورهاي TGF-B ومرگ سلولي در پاتوژنز ويروس Hong Kong /156در جوجه ها :

سويه هاي بيماريزاي ويروس آنفولانزابطور شديد باعث خسارات اقتصادي به صنعت جهاني طيور مي گردد. بسياري از مطالعات دقيق مقايسه اي نشان مي دهد كه در سويه هاي انساني ومرغي هنگ كنگي كه شناسايي شده اند انتقال متقاطع گونه اي مستقيما با تغييرات ژنهاي ويروسي مرتبط نمي باشد .
اگر چه اطلاعات زيادي در مورد ويروسهاي آنفولانزا در دست مي باشد ولي در مورد پاتوژنز ويروس هنوز داشته هاي ما خيلي كم مي باشد .
مطالعات با استفاده از سويه بسيار پاتوژنA/Turkey/Ontario/7732/66cty/ont پيشنهاد مي كنند كه كم شدن لنفوسيتها كه درجوجه اي عفوني مشاهده مي شود يك نتيجه مستقيم آپوتوزيس مي باشد . كارهاي بيشتر نشان مي دهد كه TGF-B ، يك پروتئين بسيار حفاظت شده تنظيم كننده رشد ، مستقيما بوسيله ويروس آنفولانزا فعال مي شود وآپوپتوزيس را القاء مي كند .
افزايش فعاليت TGF-Bدر 8 ساعت بعد از عفوني كردن جوجه ها با TY/ont مشاهده شد . جالب است كه ، جوجه هايي كه با غلظت معادل از A/Mallard/Wisconsin يك سويه كم پاتوژن ، عفوني شدند افزايشي در فعاليت TGF-B را نشان ندادند وسطح آپوتوزيس خيلي پايين بود .

بحث :

در اين مطالعات ما نشان داديم كه ويروس 156 هنگ كنگي ابتدا در اپيتليوم دستگاه تنفس همانند سازي مي كند و به دنبال آن به سرعت در بدن پخش مي شود . افزايش آپوپتوزيس به نظر مي رسد كه درابتداي عفونت رخ مي دهد وبا گذشت زمان افزايش
مي يابد.برخلاف ديگر سويه بسيار پاتوژن آنفولانزاي مرغي ، HK156 قادر نيست كه TGF-B را فعال كند . دليل اين مسئله نامعلوم است .
پاسخ هاي ايمني سلولي وهمورال خوك به يك عفونت با ويروس آنفولانزا يا بعد از واكسيناسيون خوكها بر عليه آنفولانزا بطور رايج بوسيله دو دفعه به روش داخل ماهيچه اي با استفاده از يك واكسن غير فعال ويروس كامل ، حاوي آدجوانت صورت مي گيرد . همچنين يك واكسن تيترهاي بالاي آنتي بادي IgG را در خون القاء مي كند ومي تواند نقش حفاظتي در برابر بروز علائم بيماري داشته باشد . اما محافظت در برابر يك عفونت وسويه هاي مختلف از نظر آنتي ژنتيكي از تحت تيپهاي مشابه هنوز بصورت سوال باقي مانده است . ما باور داريم كه يك دستور كار واكسيناسيون كه بيشتر يك پاسخ ايمني ماهيچه اي و ايمني سلولي را تحريك مي كند . مصونيت بهتري بوجود مي آورد . بنابراين ، ما شروع به مطالعه مقايسه اي بين پاسخ هاي ايمني بعد از يك عفونت طبيعي و واكسيناسيون كرديم .

بحث :

نتايج دل بر يك ترشح فعال آنتي بادي هاي موضعي IgA در ششها واعضاء بويايي وترشح موضعي IgG1 در ششها پس از عفونت باويروس آنفولانزاي مرغي
مي باشد.اين آنتي بادي هاي موكوسي مي تواند ايمني موضعي در برابر عفونت مجدد پديد آورد .
واكسيناسيون مرسوم با يك واكن حاوي ويروس كامل غير فعال به همراه ادجوانت بطور عمده پاسخ ايمني سيستميك با توليد IgA را تحريك مي كند كه در برابرنوميا ايجاد مصونيت خواهد كرد. پيشرفت روش ايمني زائي كه توليد IgA موكوسي را تحريك مي كند ممكن است يك واكسيناسيون كارآمد را فراهم سازد .
آنتي بادي هاي IgA اختصاصي براي ويروس آنفولانزا براي دوره كوتاهي پس از عفونت قابل جداسازي هستند . بنابراين ، اليزاي IgA براي تشخيص عفونت اخير ويروس آنفولانزا مي تواند استفاده شود . ( 7، صفحه 27)

قسمت چهارم :
واكسيناسيون وآنتي ويروسها

هيدروكلريد آمانتادين ويكي از آنالوگهاي آن (ريمانتادين )داروهاي ضد ويروسي براي كاربرد سيستميك براي جلوگيري از آنفولانزاي A هستند . اين داروها پوشش زدايي ( uncoating) ويروس آنفولانزاي A را در سلول ميزبان مهار مي كنند. عمل ضد ويروسي عمده عبارت است از مسدود كردن كانال يوني فعال شده بوسيله اسيد از طريق پروتئين M2 ويروسي . موتانتهاي مقاوم به دارو ايجاد شده وپخش مي گردند . آمانتادين نسبتاً غير سمي است ولي ممكن است سبب تحريك سيستم عصبي مركزي همراه با گيجي وبيخوابي خصوصاً درسالمندان گردد .
ريباويرين «يك آنالوگ نوكلئوزيد صناعي » وانترفرون در موشها فعاليتهاي ضد ويروسي بر عليه آنفولانزاي A نشان داده اند ولي شواهدي از موثر بودن آنها در انسان در دست نمي باشد . تلاشهاي منطقي براي طراحي دارو معطوف به مجموعه ترانس كريپتاز ويروسي است كه يك روند اختصاصي ويروس بوده و به مهار كردن حساس مي باشد . ( fields, vol.2)
در ايالت متحده ، واكسنهاي ويروس آنفولانزا كه بطور تجاري براي انسان ها ، اسبها وخوكها در دسترس هستند واكسنهاي غير فعال ويروس كامل يا تحت واحد مي باشند . درحالي كه اين واكسنها ممكن است ميزان مرگ ومير وشدت بيماري را كاهش دهند اما آنها نمي توانند يك مصونيت پايدار در مقابل عفونت پديد آورند : درمقابل ، بهبودي از عفونت تجربي با ويروسهاي آنفولانزا در حيوانات يك مصونيت پايدار را در برابر برخورد مجدد با عامل بيماري پديد مي آورد . ما درصدد فهم اساس ايمونولوژيك اين نوع مصونيت برآمديم وسعي در ساخت واكسنهايي كه در چنين سطحي بتوانند ايمني زائي داشته باشند گرديم .
DNA واكسيناسيون شامل تجويز DNA پلاسميدي است كه يك ايمونوژن راكد مي كند كه دراين مورد ايمونوژن مورد نظر ما HA ويروسهاي آنفولانزا بوده و به تجويز ايمونوژن به صورت پروتئيني ارجحيت دارد . DNA را مي توان به روشهاي مختلف تجويز كرد ، شامل تزريق parenteral ، استفاده درموكوس ، تلقيح با تفنگ ژني در اپيدرم . يكي از بزرگترين امتيازات اين حقيقت است كه آني ژنها به صورت denovo « بدون الگو» در سلولهاي عفوني شده ساخته مي شوند وسپس مي توانند هم به وسيله ملكوبهاي MHCI وهم MCHI عرضه شوند وهمانطور كه ايمني همورال را تحريك مي كند ايمني سلولي را نيز تحريك كنند فراتز از فراهم آوردن يك راه جديد به ايمني زائي ، DNA واكسن همچنين يك ابزار قوي و مناسب براي تعديل وفهم اساس پاسخهاي ايمني مي باشد .
ما بر روي DNA واكسيناسيون برعليه ويروسهاي آنفولانزاي مرغي وخوكي كار كرديم، با مطالعه بر روي موش شروع كرديم وسپس به اسب وخوكها منتقل كرديم در تعدادي از آزمايشاتمان DNA ، HAوپلاسميد دومي را كه IL-6 را به عنوان يك سيتوكاين ادجوانت كد مي كرد تجويز كرديم .

بحث ونتايج :

آزمايشات اوليه مادر موش نشان داد كه وكسن اسبي از نوع HAو DNA يك مصونيت نسبي پديد مي آرورد . كارآيي واكسن به ميزان قابل توجه اي بوسيله تاخير در زدن دوز يادآور از 3 تا 9 هفته افزايش پيدا مي كند . ( 90% موش هاي واكسينه شده كاملاً مصون شدند . ) اين موضوع شامل ديگر DNA واكسنها هم مي شد كه با طولاني كردن زمان يادآوري مصونيت بالا مي رود .
تجويز توأم DNA ، IL-6 انساني + پلاسميد HA اسبي يك مصونيت كامل در موش پديد مي آورد ، بطوري كه در ريه هيچ كدام از موشها هيچ ويروسي بعد از برخورد مجدد با ويروس قابل تشخيص نبود .
اضافه كردن IL-6 باعث افزايش آنتي بادي هاي اختصاصي ويروس درسرم ودر موكوس ( IgA ) ولي بطور غير منتظره سطح IgA اختصاصي در ترشحات بيني افزايش پيدا كرد . نقش بالقوه IgA موكوسي در محافظت همچنين در مطالعات ما بر روي DNA واكسن در اسبها نيز مشخص شد . در يك مطالعه مقايسه اي DNA واكسيناسيون اسب در پوست + محلهاي موكوسي « زبان وملتحمه » ، همينطور در موش ، مصونيت بر عليه ويروس با وجود IgA اختصاصي ويروس « IgGb » در ترشحات بيني وفقدان IgA قابل تشخيص همراه بود.
درمطالعات اوليه واكسيناسيون اسب بوسيله DNA ، HA + IL-6 « اسبي » حيوانات دوباره در حضور IgGb اختصاصي در سرم و ترشحات بيني مصون شدند اما درغياب IgA در زمان برخورد مجدد باويروس .
هنوز ما از مطالعات گذشته مي دانيم كه بهبودي از عفونت تجربي با ويروس آنفولانزا در اسبها پاسخ هاي قوي IgA بيني را القاء مي كند . پس ، به اين موضوع مهم بايد توجه داشت كه احتمالاً DNA واكسنها به جاي اينكه روند ايمني زائي ساده ويروس را تقليد كنند از طريق مكانيسمهاي منحصر به فردي ايجاد مصونيت مي كنند .
در مطالعات اوليه بر روي خوكها ما يك دوز پايين از DNA واكسن را بكار برديم . همانطور كه در اسبها ، تجويز DNA از طريق سطوح موكوسي بهتر از واكسيناسيون در پوست بود اما حيوانات قبل از برخورد مجدد با ويروس هيچ تغيير سرمي را نشان ندادند و در مقابل ويروس ايمن نشدند .
اما جالب است كه خوكها كه بوسيله DNA واكسينه شدند بعد از برخورد مجدد پاسخهاي قوي آنتي بادي HI را نشان دادند . پس ، يك راهي كه ما بطور رايج مي توانيم براي مصون كردن خوكها بكار بريم تجويز DNA واكسن وسپس يادآوري آنها با يك واكسن پروتئيني مرسوم مي باشد .
بعلاوه ، مطالعات با آزمايش دوزهاي بالاتر وطرق مختلف واكسيناسيون DNA واكسن و بررسي پاسخهاي ايمني دنبال گرديد .
مصون سازي جوجه ها بوسيله ويروس آنفولانزاي مرغي غير فعال و واكسنهاي نوتركيب آبله پرندگان از آنفولانزاي بسيار بيماريزاي H5 از جنبه تغييرات ژنتيكي در ويروسهاي مزارع در طول سالها .
بطور مرسوم ، كنترل آنفولانزاي مرغي بسيار پاتوژن « HPAI » از طريق تدابير سركوب كنندگي صورت مي گيرد . استفاده از واكسن به برنامه هاي كنترلي در برابر آنفولانزاي با بيماريزايي متوسط در مرغابي هاي Midwestern ايالت متحده محدود مي شود واخيراً نيز بر عليه HPAI در پاكستان ومكزيك انجام مي گيرد .
در USA ، سرويس حفاظت سلامتي گياهان وحيوانات (APHIS ) يك استراتژي را براي كنترل HPAI در آينده تنظيم كرده است كه مي تواند شامل استفاده از واكسن دريك برنامه چند جانبه ريشه كني مي باشد .
در انسانها، واكسنهاي تري والان غير فعال براي كنترل وپيشگيري تيپهاي A,B آنفولانزا مورد استفاده قرار مي گيرند اما بدليل تغييرات آنتي ژنتيكي ، واكسنها داراي عمر مفيد محدودي هستند وتركيب آنها تصميم گرفته شده كه هر ساله تنظيم شود .
سير مطالعات به اين جهت كشيده شده كه تعيين كنند آيا لازم است كه واكسنهاي برعليه HPIV H5 بطور مكرر براي فراهم آوردن يك مصونيت كافي تغيير پيدا كند .

مواد روشها :

آزمايش 1- گروههاي 10 تايي از جوجه هاي سفيد Leghorn 4 هفته عاري از پاتوژن اختصاصي بطريقه زير جلدي با هريك از 12 كانديد واكسنهاي غير فعال AI ، ايمن شدند . واكسنهايي كه استفاده شدند شامل يك مايع تخم تلقيح نشده ، يك H7AIV ده H5AIV بودند . برخورد با ويروس 3 هفته بعد از واكسيناسيون ( PV ) بوسيله تلقيح داخل بيني ( IN) به ميزان 7/7 10 ELD50 از ويروس HP Chick/Que/14588/95AIV صورت گرفت . نمونه سوآپ از دهان وگلو و كلوآك در زمان حداكثر ريزش ويروس گرفته شد ، 3 روز بعد از تلقيح ( PI ) ، براي جداسازي ويروس آن را در جنين 10 روزه تخم مرغ كشت داديم . توالي آمينواسيدي مشهور HA1 براي واكسن و ويروسهايي كه برخورد مجدد با آنها داشتند تعيين شد.
آزمايش 2-90 تا جوجه SPF WL يك روزه با يك واكسن حامل نوتركيب آبله پرندگان حاوي يك ژن HA اضافه شده از Turkey/Ireland/83(H5) « وكتور HA » ايمن شدند . 90 جوجه نيز با وكتور آبله پرندگان « وكتور كنترل » ايمن شدند .
در هفته سوم ، 10 تا از جوجه هاي ايمن شده با وكتور – HA و 10 تا از جوجه هاي ايمن شده با وكتور كنترل بصورت IN با 250 دوز كشنده جوجه از 1 تا HP AIV9 مختلف تلقيح شدند ( جدول 2 ) نمونه ها مشابه مانند بالا گرفته شدند .

نتايج :

آزمايش 1- قطعه HA1 از پروتئين HA از ويروسهاي واكسن H5 داراي 100%- 8.96از آمينواسيد هاي مشهور مشابه با HA1 از HP H5 AIV بودند . براي گروههاي واكسن H5، بيشتر جوجه هاي ايمن شده فاقد علائم كلينيكي بودند و بعد از مواجه با HPAI H5 AIV زنده ماندند . گروههاي واكسن Sham ,H7 داراي 100% بيماري و و 90% مرگ ومير بعد از مواجه با ويروس مشابه با گروههاي بالا بودند . AIVدر 83% جوجه هاي با التهاب حفره گلو دهاني از 12 گروه در روز سوم PI جدا شد .
تيترAIV بدست آمده 305-103 10ELD50/ml از محيط كمتر براي واكسنهاي H5 همانطور كه با گروههاي sham يا H7 مقايسه شد . AIV از كلوآك جوجه هاي ايمن شده با H5 كمتر جدا شد ( 20% ) وقتي كه با گروههاي ايمن شده با sham ,H7 (60%) مقايسه گرديد . تيتر ويروس براي تمامي نمونه هاي كلوآك پايين بود . آزمايش 2- قطعات HA2,HA1 از پروتئين HA داراي 87.3-100%توالي آمينو اسيدي مشهور مشابه بين 9 برخورد مجدد AIV و ويروس واكسن وكتور – HA بود . واكسن نوتركيب آبله پرندگان H5 يك مصونيت كامل را در برابر مرگي كه به دنبال برخورد با نه H5 HP AIV رخ مي داد شدند . گروههاي كنترل داراي ويروسهاي جدا شده از اوروفارنيكس « 90% » و « 88% » كلوآك بودند. گروههاي وكتور –HA حذف شدند يا به حداقل رسانده شدند ، AIV از كلوآك در 9 گروه واز اوروفارنيكس در تمام گروهها به جز chicken/Queretaro/14588/959 chicken/PA/1370/83 (7، )

بحث :

داده ها نشان مي دهند كه تغييرات مكرر واكسنهاي H5 AI ممكن است براي پديد آوردن يك مصونيت كامل از بروز علائم كلينيكي ومرگ دراثر ويروسهاي مزارع ضروري نباشد . ايمن زائي با اين واكسنها بايد ريزش AIV رااز اروفارينكس و كلوآك جوجه هايي كه در معرض AIV قرار گرفته اند كم كند . ليكن ، ويروسهايي كه داراي 90% همولوژي در HA با واكسن هستند و در معرض مجدد ويروس قرارمي گيرند ممكن است كه در ريزش AIV از اوروفارنيكس كاهش نشان ندهند . محافظت از موش با زاناميوير و ريمانتادين بعد از عفونت در موشهاي عفوني شده با ويروس A/Hong Kong/156/97( H5N1 ) با زاناميوير و ريمانتادين

مقدمه :

به دليل اينكه ويروس بسيار پاتوژن A/Hong Kong /156/97(H5N1 ) داراي شيفت آنتي ژني در آنتي ژنهاي سطحي HA ,NA مي باشد واكسنهايي كه هنگام شيوع اين ويروس استفاده شد قادر به مصون سازي نبود . آمانتادين وريمانتادين برعليه عفونت ها و ويروسي آنفولانزا A موثر هستند . ليكن ، استفاده از اين دارو ها بوسيله ظهور سريع موتانت هاي مقاوم به دارو و عوارض جانبي خود داروها محدود مي گردد. يك داروي جديد ضد آنفولانزا، زاناميوير، نشان داده شده كه برعليه عفونت آنفولانزاي A,B در موش ، موش صحرائي وانسانها موثر مي باشد وبخوبي تحمل مي شود .ليكن ، علي رغم پتانسيل بالاي زاناميوير بر عليه NA ويروسهاي آنفولانزاي بسيار پاتوژن در in vitro ، دارد قادر به محافظت جوجه ها برعليه تعدادي از سويه هاي طاعون پرندگان نمي باشد .
اين مسئله براي تحقيق مهم مي باشد كه چگونه زاناميوير برعليه اين سويه بخصوص ويروس در سيستم پستانداران موثر مي باشد .

بحث :

در اين مطالعه ما عفونت آنفولانزاي (H5N1) HK/97 را در مدل پستانداري وايجاد كرديم ونشان داديم كه تجويز داخل بيني zZanamivir وتجويز دهاني ريمانتادين باعث ايجاد محافظت در برابر عفونتهاي كشنده مي كند اين موضوع بوسيله سه شاخص كنترل گردد:
كاهش در تيترهاي ويروسي شش ، كاهش در بيماريزائي كه از طريق كاهش وزن بررسي گرديد ، وكاهش در مرگ و مير هم بطور مطلق از طريق تعدادآنهايي زنده اند وهم بوسيله كنترل زمان بين عفونت ومرگ بعنوان MSD يا ميانگين طول روزهاي عمر . اين داده ها دلايل منطقي را براي مطالعات بعدي بر روي زاناميوير وداروهاي وابسته در درمان ويروسهاي آنفولانزاي مرغي با قدرت عبور از سدهاي بين گونه ها وبيماريزائي در پستانداران فراهم آورد .
ليكن بايد به خاطر داشت كه داده هاي گزارش شده در اينجا براي پيشگيري ودرمان بيماري ممكن است منعكس كننده غلبه اين دارو درزمان تاخير در درمان نباشد .
ايمونوژنسيته گليكوپروتئين هاي آنفولانزا با فرمهاي مختلف سازماندهي سوپر ملكولي راهي كه يك Ag به سيستم ايمني عرضه مي شود اغلب براي دستيابي به پاسخ ايمني عملي تعيين كننده مي باشد . نشان داده شده كه يك Ag مي تواند وقتي كه در يك حالت مجتمع ، به فرم كلوئيدي براي مثال بعنوان مسيل پروتئين عرضه گردد بيشتر آنتي ژنتيك مي گردد.
گليكوپروتئين هاي قابل حل Envelop ويروس آنفولانزا بر روي كمپلكس هاي ملكولي مختلف مانند مسيلها ، ليپوزمها و ISCOM ها از طريق بر هم كنش هاي هيدروفوبيك دمين ها انتقالي غشاء راحت تر سوار مي شوند .
بنابراين تغيير فرم سوپرملكولي گليكوپروتئين جدا شده يكي از راههاي احتمالي براي افزايش ايمونوژنسيته مي باشد .
هدف از اين مطالعه تحقيق بر روي فعاليت ايمونوژنيك ساختمانهاي آنتي ژني مختلف ( ميسل ها ، ISCOM ها ) تهيه شده از آنتي ژنهاي گليكوپروتئين ويروس آنفولانزا مي باشد ( سويه A/FPV/Rostock/34 ) .( 7، صفحه 68)

بحث :

نتايج بدست آمده نشان مي دهد كه فرمهاي مختلف ملكولي آنتي ژن سطوح مختلف ايمني همورال را تحريك مي سازد . ISCOM ها بهترين فرم تحريك كننده سيستم ايمني از گليكوپروتئين هاي خالص FPV است كه سطح بالايي از ايمني همورال را نسبت به ميسل گليكو پروتئين ها تحريك مي سازد . ISCOM ها همچنين يك سطح بالايي از آنتي بادي ها را در زرده تخم مرغ تحريك مي سازند.
تيتر آنتي بادي زرده تخم مرغ مرتبط با سطح آنتي بادي هاي سرم مي باشد .

كارآيي ريمانتادين در برابر آنفولانزاي پرندگان :

آنفولانزاي مرغي درفرم كلاسيك طاعوني (FCP)به ندرت پديد مي آيد .ليكن ، در تعدادي از كشورهاي دنيا اين عفونت بوسيله شيوعهاي epizootic ظاهر مي شود ، كه توسط سويه هاي ويروس آنفولانزا از ديگر تحت تيپها ، كه بوسيله بيماريزايي كم در مقايسه با ويروس FCP مشخص مي شدند . بيماريهاي تنفسي بويژه اپيزوتيك هاي آنفولانزا ميان جوجه ها ، معمولاً با بيماريهاي اپيدميك در ميان مردم همزمان مي شد يا اينكه كمي بعد از آن رخ مي داد . مكرراً اين ويروسهاي تغيير يافته آنفولانزا از جوجه هاي عفوني شده وپرندگان synanthropic كه باعث بيماري در آنها مي شود جدا شده اند وبا آنتي ژنهاي واقعي براي انسان مشابهت داشت .

نتايج :

بعد از بكار بردن ريمانتادين در روزهاي 5 تا7 درمان ، علائم كلينيكي آنفولانزا ناپديد گشت ميزان تلفات پرندگان به ميزان 3و8% كاهش پيدا كرد. تيتر آنتي بادي هاي اختصاصي در 5 و2% از سرمهاي تست شده يافته شد ، درحالي كه درگروه جوجه هاي درمان شده با اريترومايسين اين درصد 21% مي باشد . اثر درماني ريمانتادين برعليه آنفولانزاي پرندگان 85و7% ساختگي مي باشد .

بحث :

نتايج بدست آمده تاثير بالاي درماني ريمانتادين را در طول درمان آنفولانزا در پرندگان در مقايسه با اريترومايسين تاييد مي كند . با استفادهاز روش اسپري كردن ريمانتادين ميزان مورد استفاده كمتر مي شود وقيمت تمام شده نيز كمتر مي گردد و كارآيي نيز بالا مي رود .

شناسايي وتحت تيپ بندي ويروسهاي آنفولانزاي مرغي بوسيله RT-PCR :

ويروس آنفولانزاي مرغي بوسيله RT-PCR با استفاده از يك سري پرايمرهاي اختصاصي براي ژن نوكلئوپروتئين ( NP ) ويروس آنفولانزاي مرغي صورت
مي گيرد.
تحت تيپهاي HA ويروس آنفولانزاي مرغي بوسيله انجام همزمان 15 واكنش RT-PCR تعيين مي گردد ، هر كدام با استفاده از يك سري پرايمر اختصاصي براي يك تحت تيپ HA براي يك سويه تنهاي ويروس يا جدا شده ، فقط يكي از 15 واكنش RT-PCR محصولات با اندازه اي كه انتظار داريم راتوليد مي كند و در نتيجه تحت تيپ HA ويروس آنفولانزا تعيين مي گردد . نتيجه تحت تيپ HA سپس بوسيله بررسي توالي هاي محصولات PCR تاييد مي گردد. تمامي 80 سويه ياويروسهاي آنفولانزاي جدا شده بوسيله روش RT-PCR تحت تيپ بندي شدند ونتيجه RT-PCR يك انطباق عالي « 100% » با نتايج روش سرولوژيكي مرسوم داشت . اين روش RT-PCR سري وحساس مي باشد و مي توان براي شناسايي وتعيين تحت تيپ HA ويروس آنفولانزاي مرغي در ارگان هموژنه شده استفاده كرد .
REFERENES :
1)Basic Information About Avian Influenza FACT SHEET , 2004.
2)Avian Influenza in Poultry1 UNIVERSITY of FLORIDA.
2)HIGHLY PATHOGENIC AVIAN…. Communicable Diseases network , 2004.
3)WHO interim guidelines on clinical ….2004.
4)Combined PCR – HeteroduPLex…
Jornal of Microbiology , 2001.
Neurovirulence in Mice of H5N1… ( 5
American Society fo Microbiology 2003.
6)INFLVENZA . A VIRUS ,H5N7 ,DUCKS – DENMARK , 2003
7)Symposium on Animal Influenza …..1999.
8)The evolution of H5N1 …. 2004.
9)Identification and subtyping of avian …
منبع: http://www.farsvet.ir
/خ