همان طور که در مطالب پيشين ذکر شد، بسياري از پروتيين‌هايي که توسط ژن‌هاي vir رمز مي‌شوند، نقشي ضروري در فرآيند انتقال ژن به واسطه آگروباکتريوم دارند. برخي از اين نقش‌ها در چندين مقاله مروري برجسته شرح داده شده است، بنابراين در مقاله حاضر، نقش‌هاي پروتيين‌هاي Vir که مي‌توانند با هدف بهبود فرآيند انتقال ژن مورد دست‌ورزي قرار گيرند، به طور محدودتري توضيح داده شده است. پروتيين‌هاي VirA و VirG به عنوان عضوي از يک سيستم تنظيمي ژنتيکي دو بخشي حسي-ترارساني پيام عمل مي‌کنند. VirA يک شاخک پري‌پلاسميک است که حضور ترکيبات فنلي گياهي خاصي را در زمان زخم القا مي‌شود، حس مي‌کند. VirA با هماهنگي با يک مولکول حامل مونوساکاريدي به نام ChvE و در حضور مقدار مناسبي فنل و مولکول قند، خود و پروتيين VirG را فسفريله مي‌کند. VirG در حالت غير فسفريله غيرفعال است، اما در حالت فسفريله، اين پروتيين به فعال شدن يا افزايش سطح رونويسي ژن‌هاي vir کمک مي‌کند. اين کار احتمالاً از طريق برهمکنش با توالي جعبه-vir که بخشي از راه‌انداز ژن‌هاي vir است، صورت مي‌گيرد. پروتيين‌هاي هميشه فعال VirA و VirG که نيازي به القا‌کننده فنلي براي فعاليت خود نداشته يا پروتيين‌هاي VirG که برهمکنش بهتري با توالي جعبه-vir براي فعال کردن ابراز ژن‌هاي vir داشته باشند، شايد براي بهبود کارآيي انتقال ژن به واسطه آگروباکتريوم و طيف ميزباني مفيد باشد.
VirD4 به همراه 11 پروتيين VirB، يک سيستم ترشحي نوع 4 که براي انتفال T-DNA و چند پروتيين ديگر Virشامل VirE2 و VirF لازم است، مي سازند. شـايـد VirD4 بـه عنــوان يـک پيونـددهنـده عمـل نمـايـد تـا برهمکنــش مـجـمـوعـه T-DNA/VirD2 با سيستم ترشحي رمزشده VirB را افزايش دهد. بيشتر پروتيين هاي VirB يا کانال غشايي مي سازند يا به عنوان ATPase، انرژي لازم براي تشکيل کانال يا فرآيندهاي خروج مولکول ها را فراهم مي کنند. چندين پروتيين شامل VirB2، VirB5 و احتمالاً VirB7 در ساختن T-pilus شرکت دارند. VirB2 اصلي ترين پروتيين پيلين است. عمل پيلوس در انتقال T-DNA هنوز روشن نيست، ولي شايد به عنوان کانالي براي عبور T-DNA و پروتيين هاي Vir عمل نمايد يا شايد فقط به عنوان قلابي براي برقراري ارتباط با سلول گياهي پذيرنده عمل نمايند و باکتري و گياه در نزديکي هم قرار داده تا انتقال مولکولي موثري صورت گيرد. جنبه مهم زيست شناسي پيلوس که شايد در انتقال ژن اهميت داشته باشد، ناپايداري آن در حرارت است. گرچه حداکثر القا ژن هاي vir در دماي 25 تا 27 درجه است، پيلوس برخي از سويه هاي آگروباکتريوم در دماهاي پايين تر (18 تا 20 درجه)، پايدارتر است. آزمايش هاي اوليه حاکي از اثر درجه حرارت بر انتقال ژن است. بدين ترتيب، برخي شايد کشت همزمان آگروباکتريوم و سلول هاي گياهي را در دماي پايين و طي چند روز آغازين فرآيند انتقال ژن مورد بررسي قرار دهند.
پروتيين هاي VirD2 و VirE2نقشي حياتي و احتمالاً کامل کننده در انتقال ژن به واسطه آگروباکتريوم بازي مي کنند. گفته مي-شود که اين دو پروتيين به همراه رشته T، مجموعه اي به نام مجموعه T تشکيل مي دهند که شکل انتقال شونده T-DNA مي-باشد. اينکه اين مجموعه داخل باکتري سوار مي شود يا نه هنوز مورد مباحثه است. Citovsky و همکارانش نشان داده اند که VirE2 مي تواند داخل سلول گياهي کار خود را انجام دهد: گياهان تراريخته توتون که توانايي ابراز VirE2 را کسب کرده بودند، با سويه هاي جهش يافته virE2 آگروباکتريوم آلوده مي شدند. چندين آزمايشگاه نيز نشان داده اند که VirE2 مي تواند در غياب رشته T به سلول گياهي منتقل شود و ممکن است که مجموعه VirE2 و رشته T، يا در کانال انتقال باکتري يا داخل سلول گياهي تشکيل شوند. نتايج تحقيقات جديد حاکي از آن است که شايد VirE2 نقش ديگري نيز در مراحل اوليه فرآيند انتقال ژن دارد: Dumas و همکارانش نشان داده اند که VirE2 در شرايط in vitro مي تواند با مشارکت غشا مصنوعي، کانالي براي انتقال مولکول هاي DNA خلق نمايند. بنابراين، ممکن است که يک وظيفه VirE2، تشکيل سوراخي در غشا سيتوپلاسمي براي تسهيل عبور رشته T باشد. به دليل اتصال VirD2 به انتهاي 5? رشته T، اين پروتيين ممکن است به عنوان راهنماي اين رشته براي عبور از کانال انتقالي نوع 4 عمل نمايد. VirD2 همچنين ممکن است در مراحل ديگري از فرآيند انتقال ژن، در داخل سلول گياهي، نقش داشته باشد. VirD2 داراي توالي “پيام مکان يابي هسته اي” (NLS) بوده که ممکن است در هدايت اين پروتيين و T-DNA متصل به آن به سوي هسته سلول گياهي، کمک نمايد. توالي NLS در پروتيين VirD2 مي تواند مجموعه هاي T ساخته شده در آزمايشگاه که شامل پروتيين هاي گزارشگر نيز مي باشند، به هسته سلول هاي گياه، جانور و مخمر هدايت کند. از اين گذشته، VirD2 مي تواند با چندين پروتيين Importin آرابيداپسيس از طريقي وابسته به NLS در مخمر و همچنين شرايط in vitro مشارکت نمايد. Importin- بخشي از يکي از مسيرهاي انتقال پروتيين هسته اي است که در يوکاريوت ها کشف شده است. داده هاي اخير نشان مي دهد که VirD2 به تنهايي براي انتقال مستقيم رشته T به هسته کافي نيست. Ziemienowicz و همکارانش نشان دادند که در سلول هاي تراوا، VirD2 مي تواند در انتقال اوليگونوکليوتيدهاي کوچـک متصل به خـود، که در شرايـط in vitro ساخته شده اند، به هسته موثر باشد، ولي نمي تواند مولکول هاي بزرگ متصل را در انتقال به هسته هدايت کند. براي انتقال اين مولکول هاي بزرگ تر، VirE2 نيز بايد به رشته T ملحق شود. نهايتاً شايد VirD2 نقشي در ادغام T-DNA با ژنوم گياهي بازي کند. جهش هاي متعددي در VirD2 مي تواند هم در کارآيي و هم در دقت ادغام T-DNA تاثير داشته باشند.
درباره نقش VirE2 در انتقال هسته اي T-DNA هم مباحثاتي وجود دارد. VirE2 يک پروتيين متصل شوند به توالي هاي غير اختصاصي DNA تک رشته مي باشد. در سلول هاي آگروباکتريوم VirE2 شايد با VirE1 برهمکنش داشته باشد و بنابراين نمي تواند براي اتصال به T-DNA در دسترس باشد. اما وقتي به DNA تک رشته متصل شود (احتمالاً در سلول گياهي)، VirE2 مي تواند DNA با ساختار پيچيده اتفاقي را تبديل به حالتي شبيه به سيم پيچيده تلفن نمايد. اين شکل طويل شده T-DNA، ممکن است به هدايت آن از طريق سوراخ هاي هسته کمک نمايد. VirE2 همچنين داراي توالي هاي NLS بوده که ابه اين دليل مي تواند پروتيين هاي گزارشگر متصل به خود را به هسته سلول گياه هدايت کند. VirE2 مثل VirD2 با پروتيين-هاي Importin- آرابيداپسيس در مخمر، از طريقي وابسته به NLS برهمکنش دارد. يک گزارش حاکي از آن است که VirE2 به DNA تک رشته متصل شده و با ريز-تزريقي به داخل سلول گياهي، مي تواند DNA را به هسته هدايت کند، گرچه گزارش-هاي ديگر نشان مي دهد که VirE2 نمي تواند DNA تک رشته متصل به خود را به هسته سلول هاي گياهي يا جانوري که براي افزايش کارآيي جذب DNA از محيط، تراوا گشته اند، رهنمون سازد. دلايل اين نتايج متناقض نامعلوم است ولي شايد منعکس-کننده تفاوت هاي نوع سلول ها و سيستم هاي ارسال DNA که توسط دو گروه استفاده شده، باشد. استفاده از سويه هاي آگروباکتريوم که يک پروتيين VirD2 جهش يافته فاقد NLS را رمز مي کنند، براي ارسال T-DNA به سلول گياهي، فقط باعث 40 درصد کاهش کارآيي انتقال ژن مي شود. گياهان تراريخته که VirE2 را ابراز مي کنند، مکمل سويه هاي جهش يافته هاي دوگانه آگروباکتريوم هستند که فاقد ژن virE2 و داراي يک نقص در ناحيه رمزکننده NLS ژن virD2 مي باشند. اين نتايج نشان مي دهد که در صورت فقدان توالي NLS در پروتيين VirD2، ساير سازوکارهاي هدف گيري هسته (مثل VirE2) جايگزين آن مي شوند.
وقتي VirE2 به DNA متصل مي شود، موتيف NLS آن مسدود و غيرفعال مي شود. اين موضوع به اين علت است که دامنه NLS و دامنه متصل شونده به DNA پروتيين VirE2 با هم همپوشاني دارند. گروه Hohn نظريه اي ارايه کرده اند که طبق آن نقش اوليه VirE2 در انتقال هسته اي مستقل از NLS بوده و VirE2 فقط به رشته T شکل مي دهد تا بتواند از منافذ هسته با حرکات مارپيچي عبور کند.
توانايي پروتيين VirE2 در مکان يابي هسته سلول هاي جانوري مورد بحث است. Ziemienowicz و همکارانش نشان داده اند که در سلول هاي تراوا شده Hela، نوع octopine پروتيين VirE2 مي تواند هسته را هدف گيري نمايد در حالي که در سلول هاي Drosophila و Xenopus که مورد ريزتزريقي قرار گرفته بودند، توالي NLS نوع nopaline پروتيين VirE2 بايد تغيير نمايد تا اين پروتيين تغييريافته در مکان يابي هسته اي موثر باشد. گرچه دليل اين اختلاف مشخص نيست ولي احتمالاً به خاطر اين نيست که يکي از دو گروه از VirE2 نوع octopine و ديگري از نوع nopaline استفاده کردند.
نهايتاً VirE2 احتمالاً رشته T را از تجزيه نوکليوتيدي در سيتوپلاسم و هسته گياه محافظت مي کند.
وجود يک مجموعه T مرکب از يک تک مولکول VirD2 که با پيوند کووالانت به انتهاي 5? يک رشته T متصل شده است و به طور منظم توسط مولکول هاي VirE2 پوشيده شده است، به طور کلي توسط مجامع تحقيقاتي آگروباکتريوم پذيرفته شده است. اما بهتر است آگاه باشيم که اين مجموعه تاکنون نه در آگروباکتريوم و نه در سلول هاي گياهي شناسايي نشده است. همچنين ممکن است ساير پروتيين ها مثل Importin، VIP1 و حتي VirF، هم به طور مستقيم و غير مستقيم با رشته T برهمکنش داشته و مجموعه T طويل تري در سلول گياهي تشکيل دهند.
گرچه عموماً ژن هايvir رمز شونده توسط پلاسميد Ti به عنوان مهم ترين عامل انتقال ژن مورد توجه هستند، بسياري از ژن هاي کروموزومي آگروباکتريوم نيز براي اين فرآيند ضروري هستند. نقش ژن هاي کروموزومي براي اولين بار با استفاده از جهش زايي اتفاقي کل ژنوم آگروباکتريوم مشخص شد. تحقيقات بعدي نقش بسياري از اين ژن ها را مشخص کرد. اين نقش ها شامل توليد، تغيير و ترشح اگزو-پلي ساکاريد (pscA/exoC، chvA و chvB) و ديگر نقش ها در اتصال باکتري به سلول هاي گياهي (ژن-هاي att)، ناقلين قند درگير در القا ژن هاي vir (chvE)، تنظيم القا ژن هاي vir (chvD) و حمل T-DNA (acvB) مي باشد. ژن هاي ديگر مثل miaA، نيز ممکن است نقش کوچکي در فرآيند انتقال ژن داشته باشند. روشن شدن توالي کامل A. tumefaciens C58، مطميناً بستر مناسبي براي کشف ژن هاي ديگري که در انتقال ژن به واسطه آگروباکتريوم درگير هستند، فراهم مي کند.
منبع:http://www.academist.ir